閆 潔,余真妍,楊洪賓,紀(jì)帥帥,霍 強(qiáng),程 秀
(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽 蚌埠 233030)
載體可以顯著改善藥物降解,高效地將藥物傳遞到靶細(xì)胞提高疾病治愈率,相比于傳統(tǒng)藥物的遞送納米載體效果更佳。其中,納米載體是一種納米級(jí)微觀范疇的藥物控釋體系,能夠穿透生物屏障、提高生物相容性和延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間,并通過(guò)保護(hù)藥物、靶向輸送來(lái)改善藥物的傳遞。納米載體進(jìn)入細(xì)胞后,經(jīng)膜泡包被于內(nèi)體中并傳遞進(jìn)入溶酶體,最后經(jīng)溶酶體逃逸成功釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在逃逸過(guò)程,納米載體保護(hù)其負(fù)載的藥物避免被溶酶體內(nèi)的酸性水解酶降解[1],這一關(guān)鍵步驟是納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)輸送治療性藥物的限速步驟。隨著載體材料的設(shè)計(jì),我們必須了解納米藥物在細(xì)胞中的行為并克服這一障礙。因此全面認(rèn)識(shí)納米載體逃逸溶酶體的機(jī)制,對(duì)于提高納米載體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率具有重要的指導(dǎo)意義。
溶酶體膜孔洞是通過(guò)膜張力和線張力的作用形成。當(dāng)膜張力大于線張力時(shí)形成孔洞,線張力大于膜張力時(shí)孔洞關(guān)閉,如多肽類細(xì)菌外毒素在pH為7時(shí)呈無(wú)規(guī)則線圈結(jié)構(gòu)[2]。隨著pH的下降,多肽中質(zhì)子化的氨基酸與溶酶體膜有較高的親和性,導(dǎo)致線張力減少而形成孔洞并保持孔洞的穩(wěn)定[3]。溶酶體膜孔隙形成固有地限制了分子大小,使藥物的釋放受到孔隙的限制,但實(shí)現(xiàn)了由細(xì)菌外毒素介導(dǎo)的溶酶體逃逸。
1.1 質(zhì)子海綿效應(yīng)“質(zhì)子海綿效應(yīng)”是納米載體藥物進(jìn)入溶酶體后,會(huì)吸收大量H+,導(dǎo)致跨膜電壓不同,從而使膜上質(zhì)子泵持續(xù)開啟。為達(dá)到電荷平衡,細(xì)胞質(zhì)中的無(wú)機(jī)離子如氯離子內(nèi)流,質(zhì)子積累與氯離子的流入相耦合,隨著離子濃度的增加溶酶體內(nèi)滲透壓大于細(xì)胞質(zhì)中滲透壓[4]。為維持滲透壓,細(xì)胞質(zhì)中的水內(nèi)流入溶酶體,水的流入及聚合物的溶脹使溶酶體破裂,破裂的內(nèi)容物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中[5],從而促進(jìn)藥物的保護(hù)與釋放。其中,具有強(qiáng)緩沖能力的,能大量吸收質(zhì)子的載體材料起主要作用。因此,具有質(zhì)子海綿效應(yīng)的納米載體可以促進(jìn)負(fù)載的藥物進(jìn)行溶酶體逃逸,成為誘導(dǎo)溶酶體逃逸的常用策略。
1.2 溶酶體膜的融合納米藥物可以通過(guò)與膜融合誘導(dǎo)逃出溶酶體,將藥物運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。膜融合材料在中性條件下穩(wěn)定,在酸性條件下可與溶酶體膜融合。將膜融合材料結(jié)合到納米藥物載體中,溶酶體細(xì)胞質(zhì)側(cè)的陰離子脂質(zhì)重新排列,與納米載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)形成中性離子對(duì),使膜不穩(wěn)定,幫助藥物逃離溶酶體,實(shí)現(xiàn)藥物的釋放[6]。
1.3 光化學(xué)內(nèi)化光化學(xué)內(nèi)化(photochemical internalization,PCI)是光敏劑分子經(jīng)特定波長(zhǎng)的光照射后發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能,繼而在有氧條件下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)使溶酶體中的物質(zhì)避免降解并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。溶酶體的PCI是將合適的光敏劑滯留在靶向細(xì)胞的內(nèi)吞囊泡中與治療劑配合使用,被光激活后光敏劑產(chǎn)生的ROS能誘發(fā)細(xì)胞器的選擇性損傷和破壞內(nèi)吞囊泡膜,觸發(fā)治療劑的溶酶體逃逸從而釋放內(nèi)吞藥物[7]。這允許被包裹的分子逃脫并到達(dá)細(xì)胞內(nèi),同時(shí)細(xì)胞本身的生存能力未受到影響。
為了實(shí)現(xiàn)納米載體藥物逃逸溶酶體,研究者們根據(jù)上述不同的溶酶體逃逸機(jī)制,構(gòu)建了多肽、毒素、脂質(zhì)、聚合物和光敏劑集成的納米載體,這些納米載體的構(gòu)建對(duì)臨床實(shí)踐具有重要的借鑒意義。
2.1 多肽(穿膜肽)以pH敏感性肽[8]或富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽、GALA肽(glutamic-alanine-leucine-alanine acid,GALA)[9-10]修飾的脂質(zhì)體是藥物輸送領(lǐng)域最常見的工具。這些肽誘導(dǎo)脂質(zhì)雙層膜重新調(diào)節(jié)成多層,使膜不穩(wěn)定,導(dǎo)致膜融合和孔隙的形成,協(xié)助納米顆粒內(nèi)體逃逸促進(jìn)藥物釋放。最近陽(yáng)離子寡肽作為非病毒基因遞送載體引起了廣泛的關(guān)注,但是其低轉(zhuǎn)染效率限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。Wang[11]等通過(guò)使用八-D-精氨酸和四-L-組氨酸形成二硫鍵交聯(lián)的嵌合多肽,創(chuàng)建了一個(gè)高效基因載體,使用該載體遞送治療性基因腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體,以查看該基因是否可以轉(zhuǎn)移,并在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)果表明,新設(shè)計(jì)的含有多肽的載體能夠有效地將DNA濃縮成納米復(fù)合體,實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)其內(nèi)體逃逸。
2.2 毒素毒素是從生物體中分離出來(lái)的劇毒物質(zhì),在過(guò)去幾年里已經(jīng)證明這些毒素能通過(guò)形成孔或與膜融合克服內(nèi)體逃逸障礙來(lái)促進(jìn)基因表達(dá)。并且一些毒素能與納米顆粒結(jié)合以促進(jìn)納米藥物的傳遞[12]。如單核增生細(xì)胞李斯特菌能夠分泌一種李斯特菌溶血素O(listeriolysin O,LLO)毒素,在感染時(shí)逃離真核溶酶體系統(tǒng),使其能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)安全生長(zhǎng)和增殖[13]。將李斯特菌溶血素O對(duì)脂質(zhì)體修飾后增強(qiáng)了內(nèi)容物從溶酶體到細(xì)胞質(zhì)的釋放[14]。Plaza-Ga[15]等提出了利用純化的His-LLO H311A突變體蛋白及其在納米顆粒表面的結(jié)合來(lái)促進(jìn)40 nm納米顆粒在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的溶酶體逃逸。用腈基乙酸對(duì)納米顆粒進(jìn)行特異性功能化后,實(shí)現(xiàn)了LLO的表面固定化,使組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合。由于內(nèi)體的酸化使LLO蛋白從納米顆粒表面釋放,并自組裝到能穿透內(nèi)體/溶酶體膜的孔中,最終納米顆粒得以逃逸。
2.3 脂質(zhì)脂質(zhì)通過(guò)內(nèi)吞途徑內(nèi)化到細(xì)胞中并降解成脂質(zhì)體,脂質(zhì)體作為非病毒遞送系統(tǒng)的主要載體之一,也是目前研究最廣泛的將治療藥物遞送到細(xì)胞內(nèi)的納米技術(shù)工具。然而,納米顆粒的溶酶體逃逸成為開發(fā)這項(xiàng)技術(shù)的主要障礙[16]。因此需要開發(fā)出利用脂質(zhì)等載體使納米顆粒從內(nèi)體逃逸到胞質(zhì)的高效藥物傳遞。環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cyclic arginine-glycine-aspartic acid,cRGD)肽被廣泛地用作腫瘤靶向配體。Wang[17]等將DSPE-PEG2000-cRGD的后插入策略應(yīng)用于由雙子樣陽(yáng)離子脂質(zhì)(cationic lipid,CLD)和中性胞嘧啶包裹的3',3"-雙肽-siRNA(pp-siRNA)納米粒子。結(jié)果表明PP-siRNA/CLD/DNCA/DSPE-PEG2000-cRGD(PCNR)的納米顆粒能夠特異性靶向整合素αvβ3高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。此外與pp-siRNA/CLD/DNCA/cRAD(PCNA)的非靶向納米復(fù)合物相比,它可以有效下調(diào)相關(guān)蛋白水平、抑制A375細(xì)胞的細(xì)胞增殖。PCNR的攝取途徑主要取決于細(xì)胞中的內(nèi)吞和巨胞飲作用,它們可以繞過(guò)溶酶體或迅速導(dǎo)致溶酶體逸出以減少siRNA降解。表明脂質(zhì)納米載體增加了siRNA的遞送并提高了轉(zhuǎn)染效率。Qiao[18]等采用基于RNAi的免疫調(diào)節(jié)來(lái)改變腫瘤的免疫微環(huán)境的阻礙并提高化療效果。此次研究建立了具有雙重靶向性和ROS響應(yīng)的納米治療系統(tǒng)Angiopep LipoPCB(Temozolomide+BAP/siTGF-β),ALBTA遞送替莫唑胺用于顱內(nèi)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療。本研究中的納米顆粒展現(xiàn)出了良好的載藥率和穩(wěn)定性,可以有效地穿透血腦屏障,并通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞保護(hù)siRNA不被降解。ALBTA中的兩性離子脂質(zhì)(二硬脂酰磷酸乙醇胺-聚羧基甜菜堿脂質(zhì))可促進(jìn)內(nèi)體/溶酶體逸出,從而增強(qiáng)替莫唑胺的細(xì)胞毒性并提高siTGF-β的基因沉默效率。ALBTA顯著改善了免疫抑制微環(huán)境,并延長(zhǎng)了膠質(zhì)瘤小鼠的生存時(shí)間。其中,二硬脂酰磷酸乙醇胺等融合脂質(zhì)并入脂質(zhì)復(fù)合物中附著于陰離子膜上并與之融合來(lái)增加脂質(zhì)體和內(nèi)體膜之間的相互作用促進(jìn)內(nèi)體釋放,使藥物成功進(jìn)行溶酶體逃逸。
2.4 聚合物聚合物是由重復(fù)結(jié)構(gòu)單元大分子組成的,通常以共價(jià)鍵結(jié)合。近年來(lái)陽(yáng)離子聚合物由于其獨(dú)特的化學(xué)物理性質(zhì),在基因傳遞及藥物傳遞方面受到了廣泛的關(guān)注。目前可供選擇的聚合物中包括聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、樹枝狀聚合物、陽(yáng)離子聚合物、支化聚乙烯亞胺(branched-polyethyleneimine,BrPEI)和殼聚糖等。聚合物與納米顆粒相容形成復(fù)合物,并且這些聚合物能增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性、高效遞送和調(diào)節(jié)釋放。大多數(shù)基于聚合物的納米顆粒通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞,并被包裹在內(nèi)體中。為了防止納米顆粒的降解,研究者們最近采用了不同的聚合物來(lái)修飾納米顆粒,使它們可以從內(nèi)體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中[19]。目前,基因療法和化學(xué)療法的結(jié)合在癌癥治療中受到了很大的關(guān)注。由于低轉(zhuǎn)染效率和基因從納米載體的內(nèi)體逸出能力差,嚴(yán)重限制了小干擾RNA(siRNA)在臨床上的成功應(yīng)用。Cao[20]等在研究中設(shè)計(jì)了一種新型的pH響應(yīng),表面修飾的單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNT)用于阿霉素(doxorubicin,DOX)和survivin siRNA的基因傳遞。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)與甜菜堿共價(jià)綴合,然后將所得的聚乙烯亞胺和甜菜堿復(fù)合物(polyethyleneimine betaine,PB)與氧化的SWCNT進(jìn)一步合成以形成SWCNT-PB(SPB),從而表現(xiàn)出優(yōu)異的pH響應(yīng)性溶酶體逃逸性。Liu[21]等為克服基因傳遞中不同的細(xì)胞內(nèi)外的屏障,通過(guò)模塊化自組裝策略制備了具有電荷轉(zhuǎn)化性質(zhì)的腫瘤靶向和pH/氧化還原反應(yīng)性三元復(fù)合物。其中多聚體的ζ電位在生理pH值下是穩(wěn)定的,并且在pH5.5(內(nèi)/溶酶體pH)條件下從-14 mV迅速增加到+20 mV,這是由于酸敏感中酰胺鍵的斷裂,以及隨后對(duì)FA-PEI-AcO層的去屏蔽作用,導(dǎo)致復(fù)合體的內(nèi)/溶酶體逸出。Chen[22]等開發(fā)了一種獨(dú)特的pH/氧化還原雙敏感陽(yáng)離子單分子納米顆粒(nanoparticles,NP),可實(shí)現(xiàn)內(nèi)體/溶酶體逸出以及靶細(xì)胞內(nèi)部siRNA的分解,可用于腫瘤靶向的siRNA遞送。這些研究表明了設(shè)計(jì)聚合物納米顆粒在溶酶體逃逸中的重要作用,能更好地將藥物輸送到細(xì)胞中。
2.5 光敏劑光動(dòng)力療法(photodynamic therapy,PDT)是利用光敏劑(photoinitiator,PI)在適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射下產(chǎn)生有毒的活性氧(reactive oxygen species,ROS),產(chǎn)生的ROS主要是單線態(tài)氧可以破壞溶酶體,單線態(tài)氧的壽命很短,破壞范圍有限。因此,它可以破壞內(nèi)質(zhì)體/溶酶體膜,并且在不影響細(xì)胞器的情況下釋放治療內(nèi)容物。目前利用光敏劑的輔助作用已經(jīng)成為了一種用來(lái)增強(qiáng)生物大分子及藥物傳遞的高效的癌癥治療方法。這項(xiàng)技術(shù)基于光激活內(nèi)吞光敏分子,在將內(nèi)吞囊泡內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到溶酶體之前誘導(dǎo)其釋放。Liu[23]等為了克服內(nèi)源性/溶酶體的限制,提高納米藥物的臨床可利用性,設(shè)計(jì)了一種基于與脂質(zhì)雙層結(jié)合的介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles tethered with lipid bilayers,MSN@TLB)的近紅外(near-infrared,NIR)刺激響應(yīng)納米體系。在該納米體系中,親水性藥物分子唑來(lái)膦酸(zoledronic acid,ZOL)首次通過(guò)聚乙烯亞胺修飾進(jìn)入介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles,MSN)。為了防止運(yùn)輸中有效載荷的泄漏,脂質(zhì)雙層(lipid bilayers,LB)殼通過(guò)聚乙烯亞胺緩沖共價(jià)拴在MSN核上,大大提高了LB的穩(wěn)定性。同時(shí),在疏水室中引入疏水光敏劑IR-780,使體系具有光活化性能。在808 nm照射下,細(xì)胞內(nèi)化和內(nèi)體/溶酶體捕獲后,通過(guò)局部ROS的產(chǎn)生使光化學(xué)內(nèi)化介導(dǎo)的藥物產(chǎn)生釋放和溶酶體逃逸,從而實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤光動(dòng)力治療。另外Zhao[24]等將抗癌藥物阿霉素(doxorubicin,DOX)和光敏劑二氫卟吩(chlorin e6,Ce6)負(fù)載到帶相反電荷的含有陽(yáng)離子的聚合物中,陽(yáng)離子聚合物與陰離子Ce6之間的靜電吸引,表明Ce6具有比DOX更高的負(fù)載效率。在酸性條件下,由于質(zhì)子化DOX的溶解度增加,與部分質(zhì)子化聚合物的相互作用減弱,DOX呈現(xiàn)pH響應(yīng)性藥物釋放。相反,Ce6由于溶解度變化較小以及Ce6與聚合物之間的相互作用強(qiáng)烈而表現(xiàn)出對(duì)pH不敏感的釋放。通過(guò)光觸發(fā)活性氧,增強(qiáng)細(xì)胞攝取和載藥納米粒子的有效內(nèi)體/溶酶體逃逸,實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的協(xié)同化療/光動(dòng)力治療。
大多數(shù)納米顆粒通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),不可避免的被溶酶體中存在的水解酶降解,導(dǎo)致藥效降低,因此我們必須對(duì)其進(jìn)行改造修飾。目前常用的載體如毒素和穿膜肽,其能通過(guò)成孔或與膜融合克服溶酶體逃逸,毒性較大以及轉(zhuǎn)染率不高限制了其使用。脂質(zhì)生物相容性好并且能夠減少藥物降解,但極易發(fā)生免疫反應(yīng)。聚合物作為納米載體可以提高藥物生物利用率,但聚合物降解不穩(wěn)定。以及光敏劑雖然可以提高靶向性降低藥物毒性,但成分復(fù)雜穩(wěn)定性差的特點(diǎn)導(dǎo)致其使用不方便。以上納米載體雖可實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸,但均有一定的優(yōu)缺點(diǎn)。因此,必須了解不同類型的溶酶體逃逸機(jī)制,利用各種方法對(duì)不同類型的納米顆粒進(jìn)行修飾,從而開發(fā)出能夠成功逃逸溶酶體的理想載體。目前,合成逃逸溶酶體的納米粒子仍然面臨很大的挑戰(zhàn),需要研究者們進(jìn)行深入的研究。