楊明明，陳澤鵬，鄧海濱，沈會(huì)芳，楊祁云，林壁潤(rùn)，阮小蕾*

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市天河區(qū)五山路483號(hào) 510642 2.中國(guó)煙草總公司廣東省公司煙葉管理處，廣州市天河區(qū)林和東路128號(hào) 510610 3.廣東省煙草科學(xué)研究所,廣東省韶關(guān)市武江區(qū)濱江路69號(hào) 512026 4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市天河區(qū)金穎路7號(hào) 510640

由煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起的煙草花葉病是煙草生產(chǎn)上重要的病害之一，每年可造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。TMV的苗期感染是花葉病發(fā)生的主要因素［2］，因此選用有效的消毒劑對(duì)苗棚設(shè)施及育苗工具進(jìn)行消毒是減少煙苗感染病毒的主要措施［3-6］。在前期試驗(yàn)中，對(duì)8種消毒劑進(jìn)行了TMV、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的消殺測(cè)試，從中篩選出消毒效果較好的復(fù)合亞氯酸鈉［7］。復(fù)合亞氯酸鈉消毒劑是2015年通過中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部審批獲得國(guó)家認(rèn)證的三類新獸藥［8］，可用于畜、禽圈舍的消毒；也可用于防治魚、蝦的細(xì)菌性疾病和病毒性疾?。?］。復(fù)合亞氯酸鈉是一種穩(wěn)定的二氧化氯消毒劑，其殺菌能力與純二氧化氯消毒劑相似［9］。

TMV是一種正義單鏈RNA（+ssRNA）病毒，由外殼蛋白和包被于內(nèi)部的鏈狀RNA分子組成［10］。TMV基因組編碼4個(gè)蛋白，大小分別為126、183、30和17.5 kDa［11］。183 kDa蛋白與126 kDa蛋白有部分密碼子重疊［12］，其中重疊部分蛋白大小為54 kDa，含有復(fù)制酶（Replicase）保守序列［13］。126 kDa和183 kDa蛋白在病毒的復(fù)制過程中起催化作用，又稱為RNA依賴RNA聚 合 酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）。30 kDa蛋白是運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein，MP）［12］，17.5 kDa蛋白為病毒的外殼蛋白（Coat protein，CP）［13］。

復(fù)合亞氯酸鈉遇水后釋放的二氧化氯是其主要消毒成分［9］。二氧化氯對(duì)病毒的滅活機(jī)理存在不同的觀點(diǎn)。目前消毒劑滅活病毒的機(jī)理主要從消毒劑對(duì)病毒的外殼蛋白和核酸的破壞程度兩方面進(jìn)行研究［14］。由于消毒對(duì)象、消毒劑的種類、濃度、消毒條件或檢測(cè)方法的不同造成研究結(jié)果不一致［15］。Alvarez等［16］發(fā)現(xiàn)，二氧化氯滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）1型仍能夠感染宿主細(xì)胞，并能脫衣殼；而氯滅活的PV1喪失了感染細(xì)胞的能力，但核酸結(jié)構(gòu)仍然完整。由此認(rèn)為二氧化氯主要通過損傷病毒的基因組來滅活病毒；氯主要通過破壞病毒衣殼蛋白而滅活病毒［17］。Li等［18］試驗(yàn)認(rèn)為，二氧化氯和氯滅活甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）后其外殼蛋白結(jié)構(gòu)完整，可以被檢測(cè)到，表明二氧化氯主要通過破壞病毒核酸來滅活HAV。趙祖國(guó)［15］通過對(duì)二氧化氯和氯滅活PV后病毒基因組的破壞情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二氧化氯和氯均是通過破壞病毒核酸來滅活PV的。對(duì)PV的致死性損傷位點(diǎn)均位于病毒基因組的5’端的非編碼區(qū)內(nèi)，但二者在損傷基因的具體位點(diǎn)上存在差異［15］。劉艷芝［19］分析了二氧化氯滅活水中腸道腺病毒41型的病毒核酸和衣殼蛋白被破壞的情況，發(fā)現(xiàn)二氧化氯滅活病毒時(shí)核酸損傷先于衣殼蛋白，衣殼蛋白損傷與病毒感染性消失不相關(guān)。單金洋［20］研究了二氧化氯滅活腸道病毒71型的病毒感染性消失與病毒基因組結(jié)構(gòu)損傷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)5′-NTR區(qū)域的1～118 nt損傷導(dǎo)致病毒感染性消失。Nuanualsuwan等［21-23］研究發(fā)現(xiàn)，用氯或紫外線對(duì)PV1進(jìn)行滅活時(shí)，對(duì)病毒衣殼蛋白的損傷是這兩種消毒方式滅活病毒的主要機(jī)制。有關(guān)二氧化氯在煙草生產(chǎn)中用于消毒劑的報(bào)道較多［24-25］，但二氧化氯滅活TMV的機(jī)理尚鮮見報(bào)道。為此，采用實(shí)時(shí)定 量RT-PCR（Real time Quantitative RT-PCR，qRT-PCR）、間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等技術(shù)綜合分析了復(fù)合亞氯酸鈉對(duì)TMV相關(guān)基因的表達(dá)、外殼蛋白結(jié)構(gòu)、病毒粒子侵染活性及整體結(jié)構(gòu)的影響，旨在明確復(fù)合亞氯酸鈉滅活TMV的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試毒源及抗血清供試病毒：TMV（普通株系）保存在普通煙草（Nicotiana tabacum）上，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室提供。TMV特異性抗血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室提供。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ig G購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 枯斑寄主

心葉煙（N.glutinosa）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室提供。

1.1.3 供試藥劑

復(fù)合亞氯酸鈉由廣東省農(nóng)科院植保所提供，用清水配成濃度為500 mg/L。中和劑為1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫代硫酸鈉+l%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）卵磷脂+1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Tween80/PBS，均購(gòu)自河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 感染病毒煙草組織總RNA的提取

采用植物組織RNA提取試劑盒（寶生物工程大連有限公司）提取煙草總RNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已報(bào)道的TMV Longlin-2（GENBANK：HE818434.1）的基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Vector NT1 explorer、Primer 5.0和Oligo設(shè) 計(jì)PCR擴(kuò)增 引物。引物由寶生物工程大連有限公司合成。普通PCR引物信息見表1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息見表2，大片段步移RT-PCR引物信息見表3。

表1 普通RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

表2 qRT-PCR引物信息Tab.2 Primer information of qRT-PCR

表3 TMV基因組大片段步移RT-PCR引物信息Tab.3 Primer information of large segment step RT-PCR for TMV genome

1.2.3 一步法RT-PCR反應(yīng)

以抽提的待測(cè)植物組織樣品的總RNA為模板，采用上述設(shè)計(jì)引物及Vazyme HiScriptⅡOne Step RT-PCR Kit一步法試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為：RNase free ddH2O 17.5μL，2×One Step Mix 25μL，One Step Enzyme Mix 2.5μL，F(xiàn)orward Primer(110μmol/L)2μL，Reverse Primer(10μmol/L)2μL，模板RNA 1μL，共50μL。一步法RT-PCR反應(yīng)程序：50℃30 min；94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s,35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)樣品取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μL 6×Loading Buffer混勻后在1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠上電泳，100 V 30 min，在UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。

1.2.4 TMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（美國(guó)GenStar公司）對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。與pMDTM18-T載體（寶生物工程大連有限公司）進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。獲得的候選轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將TMV CP和TMV Rep的重組質(zhì)粒按1×10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108稀釋成8個(gè)梯度，并分別將其作為熒光定量PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到溶解曲線和擴(kuò)增曲線，以稀釋的質(zhì)粒對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)、CT值作為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將樣品的CT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即得到樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。

1.2.5 病毒樣本處理及qRT-PCR檢測(cè)

取1 g感染了TMV且癥狀明顯的煙草葉片，加50 mL去離子水和適量23μm金剛砂充分研磨并用滅菌紗布過濾，取上清液，即為病毒液。經(jīng)檢測(cè)，病毒液中TMV含量為3.72×1010copies/μL。

復(fù)合亞氯酸鈉（500 mg/L）與病毒液混合后分別處理15、30、45和60 min，對(duì)照為清水。對(duì)處理后的病毒液進(jìn)行CP和Rep表達(dá)量檢測(cè)。操作方法：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。反應(yīng)體系：2×RT Mix 10μL，HiScriptⅡEnzyme Mix 2μL，Random hexamers（50 ng/μL）1μL，Oligo（dT）23VN（50μmol/L）1μL，RNA 1μL，ddH2O 5μL，共20μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：25℃5 min；50℃15 min；85℃2 min。

以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，使 用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試 劑盒（日 本TaKaRa公 司）對(duì)qRT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）1μL，Reverse Primer（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，滅菌水8.5μL，共25μL。反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。

1.2.6 TMV CP的抗原破壞性測(cè)定

用復(fù)合亞氯酸鈉（500 mg/L）分別對(duì)1.2.5節(jié)制備的病毒液處理15、30、45和60 min，處理結(jié)束后分別在處理液中加入適量中和劑中和。取中和后的病毒液200μL用間接ELISA檢測(cè)TMV CP的破壞程度（即抗原破壞性檢測(cè)）。每處理分別檢測(cè)6個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均吸光度值（OD值）。以藥劑與中和劑反應(yīng)產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，以中和產(chǎn)物加毒源作為陽(yáng)性對(duì)照，以清水作為空白對(duì)照。

采用間接ELISA分析TMV CP的抗原活性［26］。判斷方法：用BIO-RAD酶標(biāo)儀檢測(cè)在492 nm波長(zhǎng)下各樣品的OD值。用試驗(yàn)組OD（S）值與陰性對(duì)照OD（N）值的比值來判斷TMV的抗原破壞性。當(dāng)S/N≥2.1時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性，即CP結(jié)構(gòu)完整，沒有被破壞；＜2.1為陰性，即CP結(jié)構(gòu)被破壞，不能檢出。

1.2.7 TMV的侵染活性測(cè)定

病毒接種及枯斑統(tǒng)計(jì)：以制備的TMV病毒液作為接種液。將復(fù)合亞氯酸鈉藥液與TMV接種液等量混合，室溫分別處理15、30、45和60 min后以半葉法摩擦接種枯斑寄主心葉煙，每處理接種6株。接種前噴灑適量金剛砂于葉片表面，每片葉的左半葉接種去離子水處理的TMV接種液（對(duì)照），右半葉接種經(jīng)藥劑處理的TMV病毒液。每半片葉接種200 μL，接種后清水噴霧沖洗葉面，重復(fù)3次。接種后5～7 d統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)（取6片半葉的平均值），并計(jì)算枯斑的抑制率。

1.2.8 TMV相應(yīng)基因片段的損傷檢測(cè)

用復(fù)合亞氯酸鈉分別對(duì)制備的病毒液處理15、30、45和60 min。將處理后的病毒液采用半葉接種法分別摩擦接種于健康煙株上，以未處理的病毒液為對(duì)照。接種后1周，分別用引物對(duì)T1～T6（表3）進(jìn)行大片段步移RT-PCR檢測(cè)，分析接種植株不同部位TMV基因組片段的損傷情況。引物對(duì)擴(kuò)增TMV基因片段見圖1，其擴(kuò)增區(qū)域分別為T1：183kDa-1；T2：183kDa-2；T3：183kDa-3；T4：183kDa-4；T5：54 kDa；T6：CP&MP。接種葉片及取樣點(diǎn)見圖2，每處理分別取6個(gè)點(diǎn)，分別為對(duì)照葉、接種葉葉脈、接種葉葉柄、莖、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片，用于RT-PCR檢測(cè)。

圖1 大片段步移RT-PCR擴(kuò)增TMV基因區(qū)域Fig.1 Amplification of TMV gene regions by large step RT-PCR

圖2 復(fù)合亞氯酸鈉處理病毒液接種及取樣部位Fig.2 Inoculated locations with poisonous fluid of compound sodium chlorite and sampling locations of tobacco

1.2.9 TMV病毒提純與處理

參照Gooding等［27］的方法進(jìn)行TMV的提純。用復(fù)合亞氯酸鈉分別對(duì)病毒提純液進(jìn)行混合處理1.0 h和1.5 h，以未經(jīng)過處理的病毒提純液為對(duì)照。

1.2.10 TMV電鏡觀察

將對(duì)照和經(jīng)過消毒劑處理的病毒樣品分別采用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，負(fù)染后的病毒液在透射電鏡（JEM-1230型，日本電子株式會(huì)社）下觀察。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

繪制的TMV CP和Rep基因qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖3。圖3結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率接近理想值，相關(guān)系數(shù)接近1.000。擴(kuò)增曲線平滑，無非特異性擴(kuò)增，未產(chǎn)生引物二聚體；各循環(huán)閾值間隔均勻，清水對(duì)照則無擴(kuò)增。說明本研究中構(gòu)建的qRT-PCR體系可靠，能夠用于TMV CP和Rep基因表達(dá)量的檢測(cè)。

圖3 TMV CP和Rep質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品qRT-PCR的相關(guān)曲線Fig.3 Correlation curves of plasmid standard qRT-PCR of TMV CP and Rep

2.2 復(fù)合亞氯酸鈉處理對(duì)CP和Rep基因表達(dá)量的影響

復(fù)合亞氯酸鈉處理后，TMV CP和TMV Rep基因表達(dá)量見表4。隨著消毒處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)基因的表達(dá)量均大幅降低。處理15 min時(shí)，兩個(gè)基因仍有少量表達(dá)；處理30 min及以上時(shí)，基本沒有新的CP基因表達(dá)；處理60 min時(shí)，沒有新的Rep基因表達(dá)。

表4 復(fù)合亞氯酸鈉處理TMV后CP和Rep基因表達(dá)量的變化①Tab.4 Expression levels of CP and Rep genes after treatment of TMW with compound sodium chlorite

2.3 復(fù)合亞氯酸鈉處理對(duì)TMV抗原破壞性和侵染活性的影響

復(fù)合亞氯酸鈉處理后TMV的抗原破壞性和侵染活性的變化情況見表5。處理15 min時(shí)，TMV的抗原破壞率為83%。此時(shí)的病毒粒子還存在侵染

表5 復(fù)合亞氯酸鈉對(duì)TMV的抗原破壞性和侵染活性的影響Tab.5 Effects of complex sodium chlorite on antigen destruction and infective activity of TMV

活性，能夠在枯斑寄主心葉煙上產(chǎn)生枯斑，其枯斑抑制率為80%。處理30～60 min時(shí)，TMV的CP被完全破壞，此時(shí)也完全喪失了對(duì)枯斑寄主心葉煙的侵染能力。

2.4 復(fù)合亞氯酸鈉處理對(duì)TMV基因破壞性的影響

取感染TMV的煙草葉片總RNA，以T1～T6共6對(duì)引物分別進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，TMV基因組的所有區(qū)域均可正常擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期相符。表明6對(duì)引物均具有良好的特異性。

圖4 TMV基因組大片段步移RT-PCR引物對(duì)驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Validation results of primer pairs for large segment step-by-step RT-PCR of TMV genome

復(fù)合亞氯酸鈉處理后TMV基因組片段的損傷結(jié)果見表6。未經(jīng)藥劑處理的TMV具有較強(qiáng)的系統(tǒng)性侵染煙草的能力，在6個(gè)取樣位點(diǎn)均能夠擴(kuò)增出完整的基因片段。藥劑處理15 min時(shí)，引物對(duì)T2在煙草莖、引物對(duì)T2和T4在接種葉上部葉片與接種葉下部葉片、引物對(duì)T6在接種葉下部葉片上沒有擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，結(jié)果均呈陰性。除此以外，引物對(duì)T1～T6在其他所有檢測(cè)部位上均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，結(jié)果均呈陽(yáng)性。藥劑處理30 min時(shí)，引物對(duì)T2、T4和T6在煙草的對(duì)照葉、莖、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，除此以外，引物對(duì)T1～T6在其他所有檢測(cè)部位均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，結(jié)果均呈陽(yáng)性。藥劑處理45 min時(shí)，引物對(duì)T1、T3和T5在煙草接種葉葉脈、接種葉葉柄和接種葉上部葉片的擴(kuò)增結(jié)果仍呈陽(yáng)性，其他部位的檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。表明TMV的183kDa-2、183kDa-4和CP&MP這些基因區(qū)域?qū)ο緞┑牡挚沽ψ钊酰紫仁艿綋p傷；而183kDa-1、183kDa-3、54kDa區(qū)域?qū)ο緞┯休^強(qiáng)的抵抗能力。藥劑處理60 min時(shí)，T1～T6在各部位基因片段的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，說明此時(shí)TMV的基因組被完全破壞，無法擴(kuò)增出目的片段。

表6 復(fù)合亞氯酸鈉對(duì)TMV基因不同片段的破壞情況①Tab.6 Destruction of different fragments of TMV gene by compound sodium chlorite

從復(fù)合亞氯酸鈉對(duì)TMV的抗原破壞性和侵染活性結(jié)果可以看出，復(fù)合亞氯酸鈉處理后30 min時(shí)，TMV的CP被完全破壞；TMV的滅活率為100%，表明此時(shí)TMV已經(jīng)沒有侵染活性。而大片段步移RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)合亞氯酸鈉（500 mg/L）處理TMV 30 min時(shí)，TMV相關(guān)基因結(jié)構(gòu)中的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa及CP&MP區(qū)域還保持完整，沒有被破壞。這說明復(fù)合亞氯酸鈉處理導(dǎo)致的TMV CP損傷先于核酸損傷，核酸損傷與病毒的侵染性消失無關(guān)。復(fù)合亞氯酸鈉對(duì)TMV的滅活作用主要是破壞了CP。

2.5 復(fù)合亞氯酸鈉處理對(duì)病毒粒子物理結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)合亞氯酸鈉處理對(duì)TMV粒子的物理結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的破壞作用（圖5）。未經(jīng)藥劑處理的TMV粒子結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，粒體之間表現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象，排列整齊（圖5 a）；復(fù)合亞氯酸鈉溶液處理1 h后，多數(shù)病毒粒體斷裂，排列雜亂（圖5b）；處理1.5 h后，病毒粒體斷裂成碎片狀，表現(xiàn)分散，同一視野中數(shù)量極少（圖5c）。

圖5 復(fù)合亞氯酸鈉處理后TMV病毒粒子的變化Fig.5 Variations of TMV virus particles after treatment with complex sodium chlorite

3 結(jié)論

用復(fù)合亞氯酸鈉（500 mg/L）處理TMV后：①熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藥劑處理30 min可以完全抑制TMV CP基因的表達(dá)，TMV CP被完全破壞，病毒也完全喪失了對(duì)枯斑寄主心葉煙的侵染能力；處理60 min可完全抑制TMV Rep基因的表達(dá)。②大片段步移RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藥劑處理30 min時(shí)，TMV的183kDa-2、183kDa-4以CP&MP基因編碼區(qū)在對(duì)照葉、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片和莖等4個(gè)部位首先受到損傷，不能擴(kuò)增；在葉脈和葉柄兩個(gè)部位可以正常擴(kuò)增；在所有部位的183kDa-1、183kDa-3和54kDa 3個(gè)區(qū)域均可以正常擴(kuò)增。藥劑處理45 min時(shí)，葉脈、葉柄和接種葉上部葉片的183kDa-1、183kDa-3和54kDa區(qū)域可以正常擴(kuò)增，其他3個(gè)區(qū)域不能正常擴(kuò)增。對(duì)照葉、莖、接種葉下部葉片的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa和CP&MP基因編碼區(qū)等6個(gè)區(qū)域均不能正常擴(kuò)增。藥劑處理60 min時(shí)，各部位基因組片段的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性。因此，藥劑處理造成的CP損傷是導(dǎo)致病毒侵染性消失的主要因素,核酸損傷與病毒失活不相關(guān)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，藥劑處理1.5 h后病毒粒體完全斷裂成碎片狀。