謝強(qiáng)，夏建華，徐傳濤，王飛，李慧，于衛(wèi)松，孫惠青*

1.四川省煙草公司瀘州市公司，四川省瀘州市龍馬潭區(qū)南光路374號(hào) 646000 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101

芽胞桿菌（Bacillus sp.）對(duì)多種土傳病害和線蟲具有抑制作用，兼有改善植物營(yíng)養(yǎng)和促生作用，常用于植物病害的生物防治［1-3］。芽胞桿菌在植物根際定殖后，一方面可在幼根表面形成保護(hù)層，阻斷病原菌入侵，并分泌細(xì)菌素、活性蛋白酶、脂肽類表面活性素（Suifactins）、伊枯草菌素（Iturins）和豐寧素（Fengycins）等抗生素，直接抑制根際病原菌的生長(zhǎng)［1］；另一方面還具有解磷溶鉀能力，克服鎳（Ni）脅迫［4］，增加根干質(zhì)量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［5］，提高植物抗氧化酶活性［4］和耐鹽性［6］，從而誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，抵御病原菌侵染［7］。例如Kakar等［7］研究發(fā)現(xiàn)，水稻根際芽胞桿菌Bk1、P1和Bk7不僅能抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和紋枯病菌（Rhizoctonia solani）的菌絲生長(zhǎng)；還能通過產(chǎn)生吲哚乙酸、嗜鐵素、脂肽類抗生素以及提高過氧化氫酶活性，進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)并提高水稻抗性；同時(shí)還能在根際形成生物膜，顯著抑制稻瘟病和紋枯病的侵染。根際有益菌發(fā)揮其促生防病作用的前提是能在植物根際有效定殖。檢測(cè)定殖的方法有兩種，一是利用抗生素誘導(dǎo)篩選抗藥性菌株，借助抗藥性平板計(jì)數(shù)定殖菌群；二是利用綠色熒光蛋白（GFP）構(gòu)建融合菌株，借助激光共聚焦顯微鏡觀察定殖菌群［8-9］，此方法能直接觀察菌群定殖部位及生物膜的形成，但對(duì)于一些非模式菌株有時(shí)較難獲得融合GFP的標(biāo)記菌株。此外，有研究發(fā)現(xiàn)嗜鐵枯草芽胞桿菌Bs-15［10］、蠟樣芽胞桿菌Q-7［11］、地衣芽胞桿菌G-04［11］均能有效降解有機(jī)磷類或擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，可用于土壤修復(fù)及水治理?，F(xiàn)已取得登記的芽胞桿菌制劑中，在煙草上用于防治黑脛病的產(chǎn)品有枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌共11個(gè)產(chǎn)品，用于防治赤星病的有枯草芽胞桿菌3個(gè)產(chǎn)品，用于防治野火病的有枯草芽胞桿菌1個(gè)產(chǎn)品，用于防治青枯病的有解淀粉芽胞桿菌、多黏類芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌5個(gè)產(chǎn)品［12］。有關(guān)芽胞桿菌對(duì)植物病毒的抑制作用主要是體外鈍化、抑制初侵染以及促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高抗性［13］，尚無(wú)登記藥劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium，Bm）的發(fā)酵產(chǎn)物能促進(jìn)煙苗根系發(fā)育和莖葉生長(zhǎng)，且能在體外高效鈍化煙草花葉病毒，其活性物質(zhì)包括蛋白和非蛋白兩類［14］，但其定殖效率及對(duì)煙草主要根莖類病害抑制效果的研究則鮮見報(bào)道。為此，通過室內(nèi)生物測(cè)定進(jìn)一步明確了Bm的抑菌（毒）活性，并通過抗藥性篩選獲得抗性標(biāo)記菌株Bm-rif，測(cè)定其在煙草根際土壤中和葉面上的定殖能力，以及對(duì)煙草黑脛病和青枯病的田間防治效果，旨在為生物防治菌劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）分離自煙草根際土壤，煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）和煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究中心保存，TMV-GFP由清華大學(xué)劉玉樂饋贈(zèng)。

三生煙NN（Nicotiana tobacum var.Sumsun NN）和NC89（N.tobacum var.NC89）種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室中。

1%申嗪霉素懸浮劑（貴州遵義泉通化工有限公司）和3×1011cfu/g熒光假單胞桿菌可濕性粉劑（廣東真格生物科技有限公司）均為市售。

1.2 Bm發(fā)酵上清液對(duì)煙草花葉病毒抑制作用的測(cè)定

將Bm接種到LB中，28℃、200 r/min培養(yǎng)72 h后得到菌株發(fā)酵液，將發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min去除菌體，得到發(fā)酵上清液［15］，利用半葉法測(cè)定其對(duì)TMV的抑制效果，配制成40倍濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的TMV接種液［16］。試驗(yàn)組為發(fā)酵液或發(fā)酵上清液與接種液的等量混合，對(duì)照組為L(zhǎng)B與接種液的等量混合，靜置15 min。選取生長(zhǎng)健康且葉面無(wú)病斑的三生煙NN煙株，在葉片正面主脈兩側(cè)分別摩擦接種試驗(yàn)組和對(duì)照組，每株接種3～4片葉，重復(fù)4株。26℃培養(yǎng)4 d，調(diào)查煙株枯斑數(shù)，并計(jì)算對(duì)TMV的抑制效果。

1.3 Bm無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)黑脛病菌和青枯病菌抑制作用的測(cè)定

發(fā)酵上清液經(jīng)0.22μm細(xì)菌濾膜除菌，為無(wú)菌發(fā)酵上清液，采用對(duì)峙平板法測(cè)定其對(duì)黑脛病菌的拮抗作用。無(wú)菌條件下，在燕麥平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，28℃培養(yǎng)3 d后，取直徑為3 mm的無(wú)菌濾紙片，放置在距離菌餅四周1.5 cm處，吸取50μL無(wú)菌發(fā)酵上清液滴于濾紙片上，以滴加同體積的無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)4次。28℃培養(yǎng)5 d，測(cè)量病原菌接種點(diǎn)至平板邊緣輻射生長(zhǎng)的距離R1，至拮抗菌方向輻射生長(zhǎng)的距離R2，計(jì)算菌絲徑向生長(zhǎng)抑制率［17］。

采用抑菌圈法測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)青枯病菌的抑制作用。吸取100μL青枯病菌菌懸液均勻涂布于LA平板上，取直徑為3 mm的無(wú)菌濾紙片，在平板中呈三角放置，吸取50μL無(wú)菌發(fā)酵上清液滴于濾紙片上，以滴加同體積的無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)4次。28℃培養(yǎng)2 d，測(cè)量抑菌圈直徑［18］。

1.4 Bm抗藥性標(biāo)記

采用抗生素利福平（Rif）對(duì)菌株Bm進(jìn)行抗藥性標(biāo)記。使用含有不同濃度Rif的LB培養(yǎng)液和LA固體培養(yǎng)基，對(duì)Bm進(jìn)行抗性誘導(dǎo)和篩選，Rif濃度梯度依次為10、20、40、80、120、160、200μg/mL［19］。直至篩選出在200μg/mL的Rif中可穩(wěn)定生長(zhǎng)的抗藥突變菌株Bm-rif，記錄其培養(yǎng)性狀。

1.5 抗藥性標(biāo)記菌株在土壤和煙葉葉面的定殖及對(duì)TMV抑制作用的測(cè)定

在滅菌和非滅菌土壤中，分別添加1%的Bm-rif發(fā)酵液并混勻，用花盆分裝并植入本氏煙草，每處理4盆重復(fù)，溫室培養(yǎng)、常規(guī)管理。分別在第0、3、10、17、24、31、38、45、52和59 d取1 g根際土壤，用20 mL無(wú)菌生理鹽水振蕩漂洗30 min，取100μL于含200μg/mL Rif的LA上涂板，28℃培養(yǎng)16 h，記錄目標(biāo)菌落數(shù)量［15，19］。

對(duì)兩組盆栽7葉期的本氏煙草，以10 mL/株用量的發(fā)酵液進(jìn)行葉面噴霧，在溫度28℃、相對(duì)濕度60%～80%條件下培養(yǎng)。一組分別在第0、3、8、13、18、23和30 d隨機(jī)剪取5 g葉片，漂洗后取100μL于含200μg/mL Rif的LA上涂 布平板，測(cè)定目標(biāo)菌量。另一組于葉面噴施發(fā)酵液1 d后，摩擦接種TMV-GFP，對(duì)照植株噴施含200μg/mL Rif的LB，并測(cè)定抑制效果。

1.6 Bm發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病和青枯病田間防治效果的測(cè)定

Bm發(fā)酵液用水稀釋至活菌數(shù)量106～108cfu/g，黑脛病對(duì)照藥劑為1%申嗪霉素懸浮劑500倍液，青枯病對(duì)照藥劑為3×1011cfu/g熒光假單胞桿菌可濕性粉劑150倍液，清水為空白對(duì)照。移栽時(shí)開始施藥，共施藥2次，施藥間隔期7 d，施用方式為噴淋莖基部，50 mL/株。每處理25株，重復(fù)4次。于末次施藥后10 d對(duì)煙株進(jìn)行病情調(diào)查，并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)和防治效果［20］。

2 結(jié)果與討論

2.1 Bm發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TMV、黑脛病菌和青枯病菌的抑制效果

對(duì)TMV的半葉法生物測(cè)定結(jié)果（圖1）顯示，接種后3 d，對(duì)照的枯斑數(shù)目顯著多于發(fā)酵液或發(fā)酵上清液處理（圖1A）。對(duì)黑脛病菌的對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果（圖1B）顯示，培養(yǎng)7 d，對(duì)照平板已長(zhǎng)滿菌絲，而Bm無(wú)菌發(fā)酵上清液處理病原菌菌絲沿濾紙方向菌絲生長(zhǎng)明顯被抑制。涂布青枯病菌并放置拮抗菌濾紙片培養(yǎng)2 d，對(duì)照平板長(zhǎng)滿病原菌，而Bm無(wú)菌發(fā)酵上清液的處理沿濾紙片周圍產(chǎn)生明顯的抑菌圈（圖1C）。

圖1 Bm發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)煙草花葉病毒、煙草黑脛病菌和青枯病菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effects of Bm fermentation product on TMV,Phytophthora parasitica var.Nicotianae and Ralstonia solanacoarum

表1結(jié)果顯示，Bm發(fā)酵液對(duì)TMV的抑制效果為88.4%，發(fā)酵上清液對(duì)TMV的抑制效果為74.3%，略低于發(fā)酵液。Bm無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)黑脛病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率為67.5%，對(duì)青枯病菌的抑菌圈直徑為10.0 mm。

表1 生防菌Bm發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TMV、黑脛病菌和青枯病菌的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activities of biocontrol bacterium Bm against TMV,Phytophthora parasitica var.nicotianae and Ralstonia solanacoarum

生物測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示，Bm發(fā)酵產(chǎn)物能抑制TMV、黑脛病菌和青枯病菌；其作用機(jī)制主要是拮抗作用，即Bm發(fā)酵產(chǎn)物通過體外鈍化TMV而減少初侵染，對(duì)黑脛病菌和青枯病菌主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制。但其具體活性成分尚未確定，菌株發(fā)酵液對(duì)TMV的抑制效果高于離心去菌體后的發(fā)酵上清液，說明活菌對(duì)TMV的拮抗效果更好。鑒于芽胞桿菌產(chǎn)生活芽胞，抗逆性強(qiáng)［1-2］，開發(fā)應(yīng)用中應(yīng)優(yōu)先考慮使用活菌制劑。

2.2 抗藥性標(biāo)記菌株Bm-rif的性狀分析

生防菌發(fā)揮促生防病作用的關(guān)鍵是能在作物根際穩(wěn)定定殖。通常采用構(gòu)建熒光蛋白GFP標(biāo)記的重組菌株，或篩選對(duì)Rif有抗性的馴化菌株，并開展定殖能力的檢測(cè)［21-22］。經(jīng)系列濃度Rif抗性誘導(dǎo)，獲得可穩(wěn)定生長(zhǎng)的抗性標(biāo)記菌株Bm-rif。平板培養(yǎng)結(jié)果（圖2）顯示，Bm-rif生長(zhǎng)性狀與野生型菌株Bm之間無(wú)差異，因此可用于定殖能力的檢測(cè)。

圖2 Bm菌株的單菌落形態(tài)Fig.2 Morphology of single colony of Bm strain

2.3 菌株Bm-rif在煙草根際土壤和葉面上的定殖及對(duì)TMV的抑制效果

溫室定殖試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，在非滅菌土壤中Bm-rif初始菌量為130.00×105cfu/g，培養(yǎng)第3天下降至44.12×105cfu/g，第45天后趨于穩(wěn)定，種群數(shù)量為0.04×105cfu/g。在滅菌土壤中Bm-rif初始菌量為380.00×105cfu/g，培養(yǎng)第3天為360.00×105cfu/g，隨后下降，培養(yǎng)第17天降至與非滅菌土相近數(shù)量級(jí)并上下波動(dòng)，但仍顯著高于非滅菌土壤，最終種群數(shù)量為0.47×105cfu/g。從初始添加和最終定殖的菌量水平分析，Bm更易在滅菌土壤中定殖，可能是非滅菌土中的微生物自然種群豐富，對(duì)添加的外來(lái)菌株有抑制作用。

圖3 Bm-rif在煙草根際土壤和葉面上的種群動(dòng)態(tài)Fig.3 Population dynamics of Bm-rif in tobacco rhizosphere soil and on tobacco leaves

在葉面上的初始菌量310.00×105cfu/g，與滅菌土壤中相近，但在培養(yǎng)第3天迅速下降至29.00×105cfu/g，培養(yǎng)第30天為0.02×105cfu/g，葉面定殖種群顯著低于土壤中。噴施菌液24 h后接種TMV-GFP汁液的侵染斑統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖4）顯示，與噴施培養(yǎng)液對(duì)照相比，噴施菌液處理其斑點(diǎn)數(shù)顯著降低，對(duì)TMV抑制率為44.04%。

圖4 葉面噴施Bm-rif對(duì)TMV-GFP的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of Bm-rif sprayed on tobacco leaves against TMV-GFP

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)噴施菌液3 d后再接種病毒，幾乎無(wú)抑制效果。生防菌微菌落在植物表面定殖形成生物膜，是發(fā)揮抑菌作用的重要機(jī)制［23］。Bm菌液在葉面上附著，對(duì)TMV具有鈍化和抑制初侵染的作用；當(dāng)定殖菌量處于較低水平時(shí)，則失去拮抗效果。

2.4 Bm發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病和青枯病的田間防治效果

田間防治效果試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，末次施藥后10 d，以Bm處理的煙株黑脛病發(fā)病率50.00%、病情指數(shù)10.23，顯著低于清水對(duì)照，防治效果為68.09%。以Bm處理的煙株青枯病發(fā)病率68.59%、病情指數(shù)21.84，顯著低于清水對(duì)照，防治效果為51.02%。

表2 不同處理對(duì)煙草黑脛病和青枯病的田間防治效果Tab.2 Control effects of different treatments on black shank and bacterial wilt in tobacco fields

菌株發(fā)酵液稀釋施用兩次后，前期觀察到對(duì)煙株有一定的促生作用，未觀察到毒害癥狀，這與前期室內(nèi)促生試驗(yàn)結(jié)果一致［14］。Bm主要的作用機(jī)制可能是促進(jìn)植株生長(zhǎng)而提高抗性以及在煙株莖基部定殖減少病原菌的侵染機(jī)會(huì)［1，23］。

3 結(jié)論

室內(nèi)半葉法、對(duì)峙培養(yǎng)和抑菌圈法生物測(cè)定、葉面和根際定殖及田間防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明：Bm發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)煙草花葉病毒、煙草黑脛病菌和煙草青枯病菌均具有較好抑菌（毒）活性；經(jīng)Rif抗性誘導(dǎo)獲得的抗性標(biāo)記菌株Bm-rif在平板上的生長(zhǎng)性狀與野生型菌株無(wú)差異。葉面噴施Bm發(fā)酵稀釋液能顯著抑制TMV的初侵染，根際環(huán)境更有利于菌株的定殖；煙株莖基部噴淋Bm發(fā)酵稀釋液對(duì)煙草黑脛病和青枯病具有一定的預(yù)防作用。