李華雨，李曉瑜，劉寧，薛建中，許紅濤，王茹楠，王毅博，王寧*，高凡欽

1.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司煙草行業(yè)再造煙葉重點標(biāo)準(zhǔn)研究室，河南省許昌市金葉大道666號 461000 2.漯河市質(zhì)量技術(shù)檢驗測試中心國家肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南省漯河市召陵區(qū)汾河路22號 462000 3.啟迪浦華水務(wù)有限公司，北京市海淀區(qū)中關(guān)村東路1號院8號樓23層C2602-1 100084 4.賽默飛世爾科技（中國）有限公司北京應(yīng)用中心，北京市東城區(qū)安定門東大街28號雍和大廈2號樓702-715室 100102

造紙法再造煙葉漿料中含有原料中的木質(zhì)素和半纖維素，機(jī)械制漿產(chǎn)生的大量微小纖維，工藝過程中產(chǎn)生的果膠、蛋白、無機(jī)鹽、有機(jī)酸及其他的陰陽離子等成分［1-2］。再造煙葉加工過程中，煙草漿料在密閉管道中運行，漿料中豐富的物質(zhì)在適宜條件下滋生微生物且導(dǎo)致微生物種類增多［2-4］，其中的厭氧細(xì)菌在密閉環(huán)境中發(fā)生厭氧消化，釋放出具有難聞氣味的揮發(fā)性脂肪酸，漿料的運行時間與其揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化密切相關(guān)［5-7］，同時再造煙葉漿料中的蘋果酸、草酸、檸檬酸等通過煙梗、煙末的制漿工序以及漿料濃白水的循環(huán)使用而發(fā)生變化。因此，監(jiān)控再造煙葉漿料中有機(jī)酸濃度的變化有利于保證漿料質(zhì)量，同時也可為生產(chǎn)運行中漿料的質(zhì)量評判提供一種技術(shù)手段。

有機(jī)酸的測定方法主要有GC-MS法［8-10］、HPLC法［11-12］、毛細(xì)管電泳法［13］、加壓毛細(xì)管電色譜法［14］和離子色譜法［15-17］等。GC-MS法［8-10］多用于固體樣品中有機(jī)酸的測定；HPLC法［11-12］多用于測定難揮發(fā)性有機(jī)酸，對揮發(fā)性有機(jī)酸測定的研究較少；毛細(xì)管電泳法靈敏度較低，重現(xiàn)性較差［13，18-19］；離子色譜法［15-17］測定有機(jī)酸的研究大多集中在較簡單的樣品體系中。傳統(tǒng)的SPE（Solid phase extraction，固相萃取）法多采用負(fù)壓真空萃取裝置，萃取劑流速難以準(zhǔn)確控制，而流速對提取率的影響較大；同時樣品前處理中通常使用各種對人體有害的有機(jī)溶劑，多批次的樣品前處理耗費時間較長［18］。在線的全自動化SPE系統(tǒng)，可提高樣品處理的通量和工作效率，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，安全性強(qiáng)，越來越被廣大實驗室工作者采用［20］。本研究中針對再造煙葉漿料液色度高、渾濁、成分復(fù)雜等特點，利用在線凈化及離子色譜法建立煙草漿料中有機(jī)酸的測定方法，旨在為全面了解漿料中有機(jī)酸對產(chǎn)品品質(zhì)的影響及生產(chǎn)過程中漿料駐留時間和工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持，為再造煙葉產(chǎn)品的安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

TS-0006再造煙葉漿料（河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供）。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；氫氧化鈉（AR，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；甲酸鈉（98.9%）、乙酸鈉（99.5%）、丙酸鈉（99.5%）、丁酸鈉（99.7%）、戊酸鈉（99.3%）、丙酮酸鈉（99.5%）、己酸鈉（≥99%）（標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所）；乳酸鈉（89.9%）、異丁酸鈉（99.9%）、異戊酸鈉（99.5%）、3-甲基戊酸鈉（99.5%）、4-甲基戊酸鈉（99.6%）、苯甲酸鈉（99.9%）、酒石酸鈉（99.3%）、草酸鈉（98.4%）、蘋果酸鈉（99.5%）、檸檬酸鈉（99.5%）（標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

DionexTMICS-6000高壓離子色譜儀（配全自動在線電解淋洗液發(fā)生器、溫控電導(dǎo)檢測器）、ADRS600自動電解連續(xù)再生微膜抑制器（美國Thermo Fisher公司）；ZHP-2102L恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州普天儀器制造有限公司）；Milli-Q型超純水儀（德國Merck Millipore公司）；MS204TS電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；GL-21M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DionexInGuardTMNa SPE柱（9 mm×24 mm）、DionexIonPac AG11-HC離子色譜柱（4 mm×50 mm）、DionexIonPac AS11-HC離子色譜柱（4 mm×250 mm）（美國Thermo Fisher公司）；水系針頭過濾器（0.22μm，天津富集色譜技術(shù)發(fā)展公司）。

1.2. 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量有機(jī)酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，精確至0.1 mg，配制成濃度為1.00 mg/mL的有機(jī)酸鈉單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備水溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備水溶液，配制成濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成濃度分別為10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.10及0.05μg/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 不同放置時間再造煙葉漿料的制備

取正常運行的TS-0006再造煙葉漿料，搖勻，15 min內(nèi)分裝在24個250 mL錐形瓶中，塞緊磨口瓶塞，立即放入50℃的恒溫箱中。每間隔1 h取出兩個平行樣品。

1.2.3 樣品前處理

用孔徑37μm（400目）的滌綸濾布過濾再造煙葉漿料樣品。取25 mL濾液并加入0.1 mL 4 mol/L氫氧化鈉水溶液，混勻，以12 000 r/min離心10 min，將上清液用水系針頭過濾器過濾，用離子色譜法分析濾液。離子色譜儀條件：

柱溫：30℃；恒溫箱溫度：30℃；檢測池溫度：35℃；抑制器電流：160 mA；進(jìn)樣量：25μL。KOH淋洗液洗脫梯度：0～15 min，KOH濃度為0.8 mmol/L；15～27 min，KOH濃度由0.8 mmol/L升至4.0 mmol/L；27～28 min，KOH濃度由4.0 mmol/L升至8.0 mmol/L，保持23 min；51～56 min，KOH濃度由8.0 mmol/L升至45.0 mmol/L，保持7 min；63 min時，KOH濃度降至0.8 mmol/L；流速：1.50 mL/min。

在線前處理條件：

流動相A：去離子水；流動相B：乙腈。詳見表1。

表1 在線前處理條件及閥切換時間Tab.1 Online pretreatment conditions and valve switching time

1.2.4 分析步驟

分析流程見圖1。①將樣品以自動進(jìn)樣的方式注入25μL定量環(huán)（閥2）。②樣品被800μL純水帶入Na型SPE柱，重金屬離子和過渡金屬離子被截留在Na柱上，除去金屬離子的樣品從Na柱流出來后全部流入大定量環(huán)和AG11-HC預(yù)處理柱（濃縮柱），樣品基質(zhì)中的疏水物質(zhì)被截留在AG11-HC柱上，有機(jī)酸根不被截留而進(jìn)入后續(xù)的AS11-HC離子交換柱（閥1）。③乙腈將截留在陰離子預(yù)處理柱上的樣品基質(zhì)清洗至廢液中，實現(xiàn)AG11-HC柱的清洗再生（閥1）。④由淋洗液將被測組分沖洗至AS11-HC分析柱，經(jīng)過抑制器流入電導(dǎo)檢測器。

圖1 漿料樣品中有機(jī)酸的分離分析流程Fig.1 The process of separation and analysis of organic acids in reconstituted tobacco slurry

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1 不同類型SPE柱的選擇

考察了NG1型、H型及Na型SPE柱對樣品中有機(jī)酸測定結(jié)果的影響。分別在不接SPE柱、連接NG1柱、連接H型柱、連接Na型柱4種狀態(tài)下測定添加了標(biāo)準(zhǔn)品的再造煙葉漿料樣品。結(jié)果表明，連接H型柱時樣品中乳酸、乙酸及甲酸的測定結(jié)果均比其他3種連接方式高，尤其是乙酸的濃度。這是由于H型柱的功能基是羧酸根，分析過程中其會慢慢脫落乙酸根和甲酸根［21］所致。NG1柱填料沒有帶電荷的功能基團(tuán)，運行過程中會吸附少量的小分子有機(jī)酸，因此樣品中乳酸、乙酸和丙酸的測定濃度偏低。Na型柱測得樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的濃度與不連接SPE柱基本一致。樣品中其他有機(jī)酸在4種連接狀態(tài)下測定結(jié)果的RSD均在5%以下。因此，實驗中選擇Na型在線SPE柱。

2.1.2 樣品pH對有機(jī)酸測定結(jié)果的影響

離子作用力發(fā)生在帶相反電荷的目標(biāo)化合物與SPE吸附劑官能團(tuán)之間，環(huán)境的pH是目標(biāo)化合物和吸附劑帶相反電荷的必需條件［20］。再造煙葉漿料系統(tǒng)中厭氧細(xì)菌發(fā)酵為糖酶，隨漿料放置時間的不同，釋放出的揮發(fā)性脂肪酸等代謝副產(chǎn)物的量也不同，一般再造煙葉漿料的pH為5.0～6.5。為了考察樣品pH對檢測結(jié)果的影響，分別利用Na型柱＋濃縮柱與僅用濃縮柱2種連接方式測定漿料樣品pH分別為4.1、5.3、6.1、7.0、8.0、9.0、10.9時有機(jī)酸的濃度。結(jié)果表明，不同pH樣品在僅連接濃縮柱時乳酸、乙酸、丙酸和甲酸等小分子有機(jī)酸的峰面積均較連接Na型柱＋濃縮柱時小，其中，僅連接濃縮柱狀態(tài)下酸性或堿性越大的樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的測定結(jié)果越小。圖2為漿料pH為5.3時2種連接方法的色譜圖，連接濃縮柱時樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的峰面積均比Na型柱+濃縮柱時小。

圖2 漿料樣品pH為5.3時2種連接方式的色譜圖Fig.2 Chromatograms of slurry sample by two connection methods at pH 5.3

離子色譜樣品分析系統(tǒng)中，小分子有機(jī)酸僅發(fā)生靜電作用，帶電才能被保留；較大分子的有機(jī)酸，會發(fā)生靜電吸附和分子間力2種作用。因此，小分子有機(jī)酸的檢測峰面積較小有2種可能的原因：①堿性較強(qiáng)的樣品會發(fā)生自淋洗作用而使目標(biāo)組分不被凈化濃縮柱保留；②pH太低的樣品中小分子有機(jī)酸是分子狀態(tài)，在柱子中不保留。

一般離子色譜法的分離過程中，在樣品到達(dá)進(jìn)樣閥時，會在進(jìn)樣閥處連接濃縮柱，用于富集樣品中的離子組分［22］。通過計算進(jìn)樣閥前的死體積，調(diào)整閥切換時間，加裝1 mL的大定量環(huán)（約2 m長）的方法［22］，從Na型柱流出來的樣品全部經(jīng)過大定量環(huán)進(jìn)入分析系統(tǒng)（圖1），使在線預(yù)處理不受樣品pH的影響，保證了樣品濃度的準(zhǔn)確性和測定結(jié)果的重現(xiàn)性。圖3為pH 5.3的漿料樣品在增加大定量環(huán)后2種連接方式下測定的色譜圖，小分子有機(jī)酸峰面積在2種情況下均無變化。

圖3 加裝大定量環(huán)后空白及pH為5.3時漿料樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of slurry sample at pH 5.3 and blank after adding a large quantitative loop

2.2 色譜條件的優(yōu)化

參考高質(zhì)量分?jǐn)?shù)碳酸鹽基體中陰離子的檢測方法［22］并根據(jù)離子色譜的特點，考察了KOH淋洗液質(zhì)量濃度變化對17種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離的影響，草酸根與苯甲酸根［23］、碳酸根與酒石酸根［23］、甲酸根與異丁酸根易于在同一時間被淋洗，經(jīng)過對淋洗液質(zhì)量濃度、分離時間的優(yōu)化，草酸與苯甲酸、碳酸與酒石酸均達(dá)到了基線分離（圖4）。為了避免煙草原料中含有的Cl-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-等離子對檢測結(jié)果的干擾，在標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中添加了這5種離子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（圖4）。17種有機(jī)酸與基質(zhì)中5種無機(jī)酸根離子基本達(dá)到基線分離，經(jīng)過在線SPE處理后的再造煙葉漿料樣品中的17種有機(jī)酸與基質(zhì)中5種無機(jī)酸根離子也基本達(dá)到基線分離（圖5），表明建立的色譜條件及在線處理方式能夠?qū)υ僭鞜熑~漿料中的有機(jī)酸進(jìn)行測定。

圖4 2μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of a standard solution of 2μg/mL

圖5 再造煙葉生產(chǎn)漿料的色譜圖Fig.5 Chromatogram of a reconstituted tobacco slurry

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

以各有機(jī)酸根離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）、濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.5～10.0μg/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，見表2。

表2 17種有機(jī)酸的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）Tab.2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of 17 organic acids

2.3.2 定量限和檢出限

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以信噪比10∶1和3∶1分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到LOD為0.002～0.400μg/mL，LOQ為0.010～0.900μg/mL（表2）。表明方法的靈敏度較好。

2.3.3 方法的加標(biāo)回收率和精密度

以稀釋后的再造煙葉漿料為原樣品，在樣品中以2、4、6μg/mL 3個水平加標(biāo)進(jìn)行實驗室內(nèi)回收率和精密度實驗，每個加標(biāo)水平重復(fù)測定3次，記錄峰面積并計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。3個水平平均加標(biāo)回收率范圍為90.5%～117.1%，重復(fù)測試的RSD為0.4%～4.4%。表明方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足測定要求。

表3 17種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 17 organic acids

2.3.4 精密度及穩(wěn)定性實驗

同一加標(biāo)后經(jīng)過前處理的漿料樣品進(jìn)行6次日內(nèi)和日間平行測定，考察了方法的精密度。結(jié)果表明，17種有機(jī)酸日內(nèi)、日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別在0.59%～2.57%、0.72%～4.80%之間。因此，該方法精密度較好。

對1個加標(biāo)后經(jīng)過前處理的漿料樣品和1個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（6μg/mL）在40 d內(nèi)進(jìn)行周期性測試，每次測試完成后更換樣品瓶瓶蓋，然后在4℃條件下密封避光貯存，共測試5次。結(jié)果表明，在40 d內(nèi)，再造煙葉漿料樣品及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5次測試結(jié)果的變異系數(shù)在0.1%～4.9%之間。

2.4 不同放置時間再造煙葉漿料中有機(jī)酸濃度變化

再造煙葉漿料中，乳酸、乙酸、甲酸和檸檬酸的濃度遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸（如丁酸、戊酸、己酸等），如果不對樣品進(jìn)行稀釋，濃度大的乳酸、乙酸和甲酸等的色譜峰形較差，定量準(zhǔn)確性差。為了能夠準(zhǔn)確定量，根據(jù)樣品中乳酸、乙酸和甲酸等濃度的不同將其按照不同比例稀釋后測定，結(jié)果見表4?？芍?，再造煙葉漿料在50℃恒溫箱中放置，隨漿料放置時間的延長，異戊酸的濃度先逐漸升高然后逐漸降低，放置3 h時的濃度最高，9 h后濃度變化趨緩；乙酸的濃度呈逐漸升高然后無明顯變化的趨勢；丙酮酸的濃度在4 h時開始呈較緩慢升高趨勢；4-甲基戊酸的濃度在4 h后呈較緩慢降低趨勢；甲酸、酒石酸和檸檬酸的濃度隨放置時間的延長無明顯變化；乳酸的濃度呈逐漸降低然后無明顯變化的趨勢；蘋果酸的濃度在放置8 h內(nèi)無明顯變化，然后升高再又降低；草酸的濃度放置3 h后突然升高，至6 h后無明顯變化，放置7 h后突然降低，然后呈無規(guī)律變化狀態(tài)。

表4 再造煙葉漿料樣品中有機(jī)酸的濃度Tab.4 Concentrations of organic acids in reconstituted tobacco slurry samples （μg·mL-1）

再造煙葉漿料在50℃恒溫箱中密閉放置，漿料中的厭氧細(xì)菌在厭氧消化過程中經(jīng)過水解酸化和反硝化2個階段，水解酸化階段部分有機(jī)酸的濃度逐漸升高，反硝化階段中又消耗有機(jī)酸［24］。實驗結(jié)果表明，50℃條件下隨放置時間的延長，再造煙葉漿料中乙酸和異戊酸的濃度隨漿料放置時間的延長變化顯著。

3 結(jié)論

（1）建立了在線固相萃取-離子色譜法同時測定再造煙葉漿料中17種有機(jī)酸的方法。

（2）該方法在0.5～10.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法的檢出限為0.002～0.400μg/mL，定量限為0.010～0.900μg/mL。在2、4、6μg/mL 3個加標(biāo)水平的平均回收率在90.5%～117.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%～4.4%之間。日內(nèi)測定結(jié)果的變異系數(shù)為0.59 %～2.57%，日間為0.72%～4.80%。

（3）該方法前處理簡單、操作簡便、重復(fù)性好，適用于再造煙葉漿料有機(jī)酸的測定，可為再造煙葉生產(chǎn)過程中漿料的駐留時間和工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持。