張瓊果，徐璐，李莉，莊乙君，張秋

作者單位：1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，a血液凈化中心，b血液內(nèi)科，海南 ?？?570100；2海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院血液凈化中心，海南 ?？?570100；3海南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 ?？?570100

腎移植是終末期腎病病人延續(xù)生命的重要手段，然而臨床觀察仍有較多因素可影響腎移植病人的長期生存［1］。研究表明，進行移植手術的病人腫瘤發(fā)病率高于一般人群，主要以皮膚、淋巴組織增生性腫瘤為主，彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最為常見的類型，也是影響病人預后的重要因素［2］。目前腎移植術后發(fā)生DLBCL的機制尚未明確，可能與免疫抑制劑導致EB病毒感染及淋巴細胞增殖失調(diào)有關［3］。腫瘤細胞周期相關蛋白（CREPT）是2012年常志杰教授鑒定的人類基因，并證實該基因在胃癌、直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均存在表達增高，且其水平與病人預后存在密切關系［4-6］。目前CREPT在腎移植術后DLBCL發(fā)生、發(fā)展中的作用關系仍較少有研究報道，其表達是否與其發(fā)生存在某種關系仍有待臨床探討。本研究腎移植術后發(fā)生DLBCL的病人作為研究對象，分析預后與CREPT的關系，旨在為明確DLBCL的發(fā)生、發(fā)展機制研究提供思路，為早期評估病人病情、預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年2月至2019年8月海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院、海南省腫瘤醫(yī)院、海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的腎移植術后發(fā)生DLBCL的病人作為研究對象，納入病例組，以病灶組織作為研究樣本；病例組納入標準：進行腎移植手術治療，移植手術資料完整；符合《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷及治療指南》［7］相關標準；在院進行DLBCL治療，治療資料及隨訪資料完整。排除標準：臨床資料不全者；合并其他腫瘤者；無隨訪數(shù)據(jù)者。醫(yī)院收治腎移植病人共2 104例，其中40例發(fā)生DLB?CL，40例全部納入病例組，另外選擇50例增生性淋巴結炎組織作為對照組。所有病人或其近親屬均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 一般資料：性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)。腎移植相關資料：腎移植年限、EB病毒感染情況、移植腎功能情況。DLBCL相關情況：發(fā)病位置、B癥狀（不明原因發(fā)熱、盜汗、半年體質(zhì)量下降10%以上）情況、Ann Arboe分期、生發(fā)中心表型、乳酸脫氫酶（LDH）水平、體能評分（ECOG）［8］等。

1.2.2 CREPT表達情況 采用免疫組化方法檢測CREPT的表達，石蠟包被組織，切片機制備石蠟切片，切片厚度為4μm，依次浸入二甲苯、降梯度乙醇溶液脫蠟、復水，切片置入過氧化氫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，清水沖洗后加入胎牛血清封閉10 min。加入一抗（鼠抗人CREPT單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶500，購自美國EPITOMICS公司），濕盒內(nèi)孵育過夜；室溫放置10 min后洗滌，加入二抗工作液（生物素標記的羊抗兔二抗工作液），37℃孵育30 min，洗滌，加鏈霉卵白素工作液，DAB顯色5 min，觀察顯色滿意后自來水沖洗，蘇木精復染，鹽酸分化，再進行脫水、透明、封片。采用日本奧林匹斯顯微鏡觀察切片，每張切片選擇5個高倍鏡視野，CREPT細胞定位為細胞核或細胞質(zhì)，按照染色強度及染色細胞百分比進行評價，其中不著色記為0分，淺棕黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞所占比例<25%記為1分，25%~<50%記為2分，50%~75%記為3分，>75%記為4分，染色強度與陽性細胞百分比評分乘積為染色總積分，總分0~3分為低表達，>3~12分為高表達。

1.2.3 治療及預后 參考《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷及治療指南》［7］進行治療，按照NCCN淋巴瘤臨床實踐指南［9］評估治療效果，治療效果分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進展，其中完全緩解及部分緩解視為治療有效；進行隨訪，收集病人總生存期（OS）、無進展生存期（PFS），以病理確診當日作為隨訪起點，隨訪截止時間為2021年4月，隨訪以門診復診、電話隨訪為主，其中OS為病理確診日至任何原因?qū)е滤劳龅臅r間；PFS為病理確診日至開始出現(xiàn)腫瘤進展或死亡的時間。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以頻數(shù)及率表示，組間比較行χ2檢驗或Fisher確切概率法，符合正態(tài)分布的資料以±s表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗，采用logistic多因素分析治療效果的影響因素，采用Ka?plan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗進行生存時間及生存率的分析，采用Cox比例風險回歸模型分析病人預后相關影響因素。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腎移植術后DLBCL病人CREPT表達情況CREPT定位于細胞核或細胞質(zhì)，40例腎移植術后發(fā)生DLBCL病人中，CREPT低表達者17例，高表達者23例；50例增生性淋巴結炎組織中，CREPT低表達者45例，高表達者5例，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見圖1。

圖1 腎移植術后彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）病人腫瘤細胞周期相關蛋白（CREPT）表達情況（蘇木精-伊紅染色×200）：1A為DLBCL病人CREPT強陽性表達；1B為增生性淋巴結炎組織CREPT

2.2 腎移植術后DLBCL病人CREPT表達與臨床參數(shù)的相關性低表達組及高表達組病人性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、腎移植年限、移植腎功能、B癥狀情況、ECOG分級、LDH、生發(fā)中心表型等資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高表達組EB活化率高于低表達組，高Ann Arboe分期病人比例高于低表達組（P<0.05）。詳見表1。

表1 腎移植術后DLBCL病人40例CREPT表達與臨床參數(shù)的相關性

2.3 DLBCL病人治療情況分析所有病人均進行4~6個療程的利妥昔單抗聯(lián)合化療治療，治療結束后評估療效，其中達到有效標準病人36例，無效者4例。多因素分析示，Ann Arboe分期是治療效果的影響因素（P<0.05）。詳見表2。

表2 DLBCL病人40例治療效果的影響因素分析

2.4 CREPT表達與DLBCL病人預后的關系分析截至2021年4月，病人隨訪總時間為10~96個月，中位隨訪時間為41個月，兩組PFS比較差異無統(tǒng)計學意義（log-rankχ2=2.25，P=0.133）；CREPT高表達組病人OS顯著低于低表達組（log-rankχ2=3.89，P=0.049）。詳見圖2，3。

圖2 腫瘤細胞周期相關蛋白（CREPT）高表達及低表達病人無進展生存期（PFS）的生存曲線

圖3 腫瘤細胞周期相關蛋白（CREPT）高表達及低表達病人總生存期（OS）的生存曲線

2.5 DLBCL病人預后的影響因素分析以病人OS、PFS作為因變量，以一般資料、腎移植相關資料、DLBCL資料、治療情況等資料作為自變量進行Cox多因素分析，Ann Arboe分期、治療應答情況與PFS回歸相關（P<0.05）；移植腎功能降低、Ann Arboe分期、ECOG評分、治療應答情況、CREPT表達情況與OS相關（P<0.05）。詳見表3，4。

表3 腎移植術后發(fā)生DLBCL病人40例PFS的影響因素分析

3 討論

腎移植術后DLBCL的發(fā)生對病人生存時間有較大影響，分析其發(fā)生的可能機制、尋找潛在的標志物對于臨床診治有一定臨床意義。CREPT是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的癌基因，目前認為其可通過調(diào)節(jié)細胞周期影響惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［10］。本研究結果顯示，與增殖性淋巴結相比，DLBCL病人CREPT高表達率較高，可能與DLBCL的發(fā)生相關。目前已有較多研究探討了CREPT基因表達與惡性腫瘤的關系，但與DLBCL之間的關系仍較少有研究報道。結合DLBCL發(fā)生機制分析兩者之間的關系，DLBCL以活躍的細胞增殖為主要特征，而CREPT是公認的調(diào)節(jié)細胞周期進程及細胞凋亡的基因，其表達增強可能與腫瘤的發(fā)生相關［11-12］。目前關于腎移植術后DLBCL發(fā)生的原因及機制尚未闡釋清楚，可能與腎移植術后免疫抑制導致淋巴細胞激活異常、BK感染相關［13-14］。本研究中對比了CREPT高病人及低病人的臨床資料，發(fā)現(xiàn)高表達組EB活化率高于低表達組，高Ann Arboe分期病人比例高于低表達組，推測CREPT高表達可能與EB活化狀態(tài)有一定關系，而其表達情況與病人的臨床特征存在一定聯(lián)系，但基因表達與EB活化的關系目前無研究報道，兩者之間的具體作用關系仍有后續(xù)研究探討。

表4 腎移植術后發(fā)生DLBCL病人40例OS的影響因素分析

DLBCL病人預后較差，對于本身存在免疫力低下的腎移植病人，其預后受到的影響更多。本研究結果顯示，腎移植術后DLBCL病人PFS的影響因素主要為臨床分期及治療反應性情況，這一結果與既往報道的DLBCL病人預后的相關因素類似［15-17］。隨著臨床分期的加深，病人腫瘤大小、病灶數(shù)量增加，治療難度較大，預后相對較差；治療效果主要是評估治療方式下短期療效，但研究表明，近期療效顯著的病人體內(nèi)腫瘤清除較為干凈，術后復發(fā)概率較小，有利于提高病人的無進展生存期［18］。腎移植術后DLBCL病人OS的影響因素主要有臨床分期、移植腎功能情況、ECOG評分、治療應答情況、CREPT表達情況等。腎移植手術病人術后需長期服用抗排異反應藥物，機體處于免疫抑制狀態(tài)，其遠期的長期生存除與DLBCL病情有關，也與腎功能、身體狀態(tài)有關，存在移植腎功能降低的病人遠期生存較差，ECOG評分較差的病人身體質(zhì)量較差，對于化療、治療的耐受性也較差，同樣影響遠期生存［19］。CREPT與DLBCL病人OS存在一定關系的原因可能為一方面，表達情況與病人的臨床特征存在一定關系，CREPT高表達病人臨床分期較高，這部分病人治療效果較差；另外，如上文所述，CREPT表達與BK感染存在一定關系，而后者是引起B(yǎng)K相關腎病從而引起腎功能丟失的重要原因［20］，在本研究中CREPT高表達病人BK感染率較高，遠期預后較差。既往較少有研究探討CREPT與DLBCL病人預后的關系，劉軍等［21］研究證實CREPT在腎癌組織中高表達，且病人總體生存時間及無瘤生存時間均與之相關；Wen等［22］針對宮頸癌病人的研究也證實，CREPT與宮頸癌預后密切相關，本研究在前人研究結果基礎上進一步證實這一點。當前抗腫瘤藥物研發(fā)成為臨床研究的重點及難點，CREPT作為一種與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關的蛋白，通過調(diào)控其表達或可抑制腫瘤的進展，目前已有降解CREPT多肽抑制劑在胰腺癌細胞中的應用研究，未來可能成為腫瘤新藥研發(fā)的方向。

綜上所述，腎移植術后DLBCL病人CREPT表達率較高，且與病人臨床特征、預后存在一定關系，或可為腫瘤機制研究、腫瘤新藥的研究提供新思路。本研究局限性在于本研究納入對象為腎移植術后DLBCL的病人，臨床病例較少；另外CREPT與DLBCL臨床特征的相互作用關系僅為推斷，具體作用機制仍有待后續(xù)研究探討。