魏玲玲，張麗潔，楊龍艷，趙冬

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心，糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實驗室，北京 101149）

誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞體內(nèi)再生是一種新興的治療糖尿病的方法。［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺的發(fā)育過程中有許多決定其命運(yùn)的特異性轉(zhuǎn)錄因子［4］。多項研究表明，瞬時表達(dá)多種轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)⒊赡甑囊认偻夥置诩?xì)胞轉(zhuǎn)化為類似于功能性β 細(xì)胞的細(xì)胞［5-8］。通過這種基因治療技術(shù)可以在糖尿病動物的胰腺中誘導(dǎo)出分泌胰島素的細(xì)胞。然而，由于需要多種轉(zhuǎn)錄因子，且重編程得到的分泌胰島素的細(xì)胞在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝方面的功能較弱，因此該方法的臨床應(yīng)用仍然受到限制。胰腺十二指腸同源盒因子-1（pancreatic and duodenal homeobox gene 1， PDX-1）是促進(jìn)胰腺β 細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究證實，單獨(dú)轉(zhuǎn)染PDX-1 能夠成功促使肝細(xì)胞等其他類型細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［9-12］。還有研究證實，通過小鼠腹腔注射PDX-1蛋白質(zhì)，可以逆轉(zhuǎn)小鼠糖尿病［13］。本研究中，我們嘗試PDX-1 轉(zhuǎn)染聯(lián)合胰島素治療的方法，誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺中再生胰島素分泌細(xì)胞，形成了類似于正常小鼠的胰島樣結(jié)構(gòu)，且小鼠血糖水平恢復(fù)正常，探索此種基因治療方法在糖尿病治療中的應(yīng)用價值。

1 方 法

1.1 腺病毒構(gòu)建：首先構(gòu)建目標(biāo)基因（PDX-1 或LacZ 基因）的穿梭載體，然后再構(gòu)建pAd/CMV/V5腺病毒載體（Invitrogen 公司）。采用Stratagene 公司的AdEasy 試劑盒在293 細(xì)胞中構(gòu)建重組腺病毒并純化獲得高滴度病毒（＞1×1010pfu/ml）。

1.2 糖尿病模型的建立：通過腹腔內(nèi)注射濃度為200 mg/kg 的鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma）在成年雄性C57BL/6J 小鼠中建立糖尿病模型。5 ～ 7 d 后，通過每日用Roche Diagnostics ACCU-CHEK活性葡萄糖監(jiān)測儀測量血糖（blood glucose，BG）水平，連續(xù)2 d BG ＞16.7 mmol/L 被認(rèn)為糖尿病模型建立成功。 然后將糖尿病小鼠分為4組（每組10只）：① Ad-LacZ 組。②Ad-PDX-1 組。③Ad-LacZ 加胰島素治療組。④Ad-PDX-1 加胰島素治療組。

1.3 胰腺內(nèi)注射腺病毒載體：在全身麻醉（腹腔內(nèi)注射5%氯胺酮，100 mg/kg）下，開腹向糖尿病小鼠胰腺內(nèi)多點(diǎn)注射共計100 μl（1×109pfu）腺病毒載體（Ad-LacZ 或Ad-PDX-1）。

1.4 胰島素治療：聯(lián)合胰島素治療組的小鼠每只每天皮下注射1 個單位的人胰島素（50%常規(guī)和50%NPH 的混合液）。 每天胰島素注射前測定小鼠血糖，一旦血糖水平恢復(fù)正常（BG ＜11.1 mmol/L），即停止胰島素注射。

1.5 組織學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析：獲取小鼠胰腺組織，然后進(jìn)行HE 染色和免疫組織化學(xué)（胰島素、胰高血糖素和PDX-1 染色）分析。利用ELISA 試劑盒（Millipore）檢測胰腺中的胰島素含量。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因在胰腺中的表達(dá)：為了證明轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，在腺病毒注射后3 d 獲取胰腺。 X-gal 染色檢測Ad-LacZ 載體注射后β-半乳糖苷酶表達(dá)情況，表明LacZ 在腺泡組織和一些相互連接的組織中均有表達(dá)（圖1A），但PDX-1 基因的表達(dá)似乎僅限于一些主要位于導(dǎo)管或連接組織區(qū)域的分散細(xì)胞（圖1B）。

圖1 胰腺組織學(xué)檢測顯示LacZ 基因（X-gal 染色，×200）

2.2 PDX-1 聯(lián)合胰島素治療可逆轉(zhuǎn)糖尿?。簽榱舜_定轉(zhuǎn)基因和胰島素治療的效果，用血糖儀測量各組小鼠血糖水平30 d。如圖2 所示，未經(jīng)胰島素治療，第1 組（Ad-LacZ 組）和第2 組（Ad-PDX-1 組）中的所有動物血糖水平均未變?yōu)檎?。在整個30 d 的實驗期間，血糖均保持在較高水平，兩組之間未觀察到明顯差異（P ＞0.05）。這表明單獨(dú)的PDX-1 不能逆轉(zhuǎn)糖尿病。但是，隨著胰島素的引入，Ad-PDX-1 組動物的血糖水平逐漸降低，在2 ～ 3 周內(nèi)恢復(fù)正常（BG ＜11.1mmol/L）。而且在停用胰島素（治療開始后第20 天）后血糖仍保持正常水平。相比之下，Ad-LacZ 對照組的動物在實驗期間即使注射胰島素也仍然具有高血糖，兩組具有顯著性差異（P ＜0.05）（圖2）。這些結(jié)果表明，Ad-PDX-1基因轉(zhuǎn)染與胰島素治療相結(jié)合可逆轉(zhuǎn)小鼠糖尿病，這可能是誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞再生的結(jié)果。

圖2 轉(zhuǎn)基因和胰島素治療后糖尿病小鼠的血糖變化

2.3 PDX-1 聯(lián)合胰島素治療誘導(dǎo)胰島再生：為了確定PDX-1 是否與胰島素治療聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生了胰島素分泌細(xì)胞并形成了新的胰島，研究對實驗動物進(jìn)行了組織學(xué)檢測。在對照小鼠的胰腺中未觀察到胰島素陽性細(xì)胞或只有很少的胰島素陽性細(xì)胞。在用Ad-PDX-1 聯(lián)合胰島素治療的小鼠胰腺中觀察到大量新形成的胰島素分泌細(xì)胞，而未觀察到分泌胰高血糖素的細(xì)胞（圖3A），與正常小鼠胰島（圖3B）不同。HE 染色顯示，這些新生的分泌胰島素的細(xì)胞形成胰島樣結(jié)構(gòu)（圖3C），新形成的胰島的形態(tài)與正常小鼠的形態(tài)非常相似（圖3C 和 3D），只是它們似乎起源于導(dǎo)管區(qū)域（圖 3D），其胰島大小比正常胰腺和對照組胰腺的胰島相對更大。

圖3 胰腺組織學(xué)檢測顯示Ad-PDX-1 加胰島素治療組小鼠

為了確定新形成的胰島是否正常起作用，通過ELISA 定量評估了胰腺中的胰島素含量。結(jié)果表明，Ad-PDX-1 加胰島素治療組小鼠胰腺中的胰島素含量〔微克/克胰腺，（7.8±1.3） μg/g〕比Ad-LacZ 加胰島素治療組小鼠高出5 倍以上〔（1.5±0.6） μg/g，P ＜0.05，圖4〕，表明新誘導(dǎo)的胰島具有分泌胰島素的能力，與上述觀察結(jié)果相似，即在終止胰島素應(yīng)用后血糖水平保持正常（圖2B）。這些結(jié)果表明，PDX-1 結(jié)合胰島素治療可誘導(dǎo)糖尿病小鼠胰腺中功能性分泌胰島素細(xì)胞的產(chǎn)生并形成新的胰島組織樣結(jié)構(gòu)。

圖 4 ELISA 檢測小鼠胰腺中胰島素含量（n=10）

3 討 論

以往的研究表明，異位表達(dá)PDX-1 可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞等多種細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌胰島素的細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的血糖水平至正常［9-10］。PDX-1 的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)某些胰腺基因的特異性表達(dá)，然而，這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌胰島素的細(xì)胞通常不能形成胰島樣結(jié)構(gòu)，并且不具備強(qiáng)的調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的功能。同時表達(dá)多個轉(zhuǎn)錄因子（如PDX-1、Ngn3和Mafa）的研究，能將完全分化的外分泌細(xì)胞重編程為與成熟胰島β 細(xì)胞非常相似的胰島素分泌細(xì)胞［8，14］。但這些重編程的分泌胰島素的β 細(xì)胞缺乏胰島樣組織結(jié)構(gòu)，削弱了它們的功能，且需要同時轉(zhuǎn)染3 個轉(zhuǎn)錄因子的要求也阻礙了這種方法的臨床推廣應(yīng)用。另有一些研究表明，生長因子促進(jìn)了胰腺腺泡細(xì)胞中分泌胰島素的β 細(xì)胞的再生［15-16］。將生長因子引入基因轉(zhuǎn)染過程中可能是簡化以及克服前述障礙的關(guān)鍵。

本研究中，我們將胰島素治療與單個轉(zhuǎn)錄因子PDX-1 結(jié)合使用。 這種組合有效地誘導(dǎo)了胰島β 細(xì)胞的再生，從而逆轉(zhuǎn)了糖尿病小鼠的高血糖。作為生長因子，胰島素可以增強(qiáng)，促進(jìn)和完成由PDX-1 表達(dá)引發(fā)的胰島再生過程。 同時，它還可以將高血糖癥的嚴(yán)重程度減輕到刺激或至少不損害胰島再生過程的程度。 胰腺切除的小鼠中胰島再生的研究表明，PDX-1 的表達(dá)水平與胰島素信號傳導(dǎo)中間體IRS2 和Akt 相關(guān)［17］。盡管利用腺病毒轉(zhuǎn)染PDX-1 幾乎不受胰島素信號的影響，但其翻譯和翻譯后修飾可能受這些中間體的影響。

胰腺的組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示，再生的胰島素分泌細(xì)胞具有3 個特征：分泌胰島素的細(xì)胞很好的組織成類似于正常胰島的結(jié)構(gòu)；這些細(xì)胞大部分位于導(dǎo)管區(qū)附近；新形成的胰島僅由產(chǎn)生胰島素的β 細(xì)胞組成，沒有產(chǎn)生胰高血糖素的α 細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，新的胰島是通過胰島再生過程而不是重編程機(jī)制形成的。我們推測這些新形成的胰島細(xì)胞很可能起源于胰腺內(nèi)導(dǎo)管樣前體細(xì)胞［18］，但這還需要進(jìn)一步的研究來證明。總之，利用本研究的方法再生的胰島功能正常且能夠逆轉(zhuǎn)小鼠高血糖，有可能成為糖尿病治療的理想策略之一。