費陳晨 諶 曦 楊 凱 萬 磊 范海霞 劉天陽 李 明 劉 磊 葛 瑤 王晴晴 范文杰 周 倩

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種侵犯滑膜、軟骨組織的全身性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1-3]及心、肺、腎等器官的嚴(yán)重并發(fā)癥。RA的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個生物過程，包括炎癥因子釋放和信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，但針對其機(jī)制研究尚不夠完善。目前RA常用治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等，但長期應(yīng)用的不良反應(yīng)較多，因此中醫(yī)藥在RA治療中尤為重要。

中醫(yī)上本病屬于“痹證”“尪痹”“歷節(jié)風(fēng)”等范疇，其病因不外乎正氣虧虛，風(fēng)寒濕熱等外邪侵襲機(jī)體，痹阻氣血經(jīng)絡(luò)，不通則痛[4]。威靈仙可祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，牛膝可活血化瘀、補益肝腎、強(qiáng)筋骨，兩藥配伍共奏祛風(fēng)通絡(luò)之效，主治風(fēng)寒濕痹。兩藥的臨床療效確切，均可抑制炎癥因子釋放，達(dá)到治療RA 的作用[5-6]，但介于其化學(xué)成分復(fù)雜及藥物間可能會產(chǎn)生相互作用，其靶點乃至作用機(jī)制方面的研究受到限制。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究方面成果顯著，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，可預(yù)測藥物潛在靶點與作用機(jī)制。因此，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)為基礎(chǔ)，探討威靈仙-牛膝藥對有效活性成分、潛在靶點及其治療RA 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床試驗與治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫及平臺中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP)（https://old.tcmsp-e.com/）、GeneCards(Version 5.10)(https://www.genecards.org/)、DisGeNET（v 7.0）(https://www.disgenet.org/home/)、Uniprot 通用蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)、網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)、String在線(Version:11.5)(https://cn.string-db.org/)、AutoDockTools-1.5.7（https://autodock.scripps.edu/）、pymol-2.4.0（Python Extension Packages for Windows-Christoph-Gohlke)、OpenBabel 3.0.0（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）

1.2 藥物有效成分及作用靶點的篩選以“威靈仙-牛膝”藥對為關(guān)鍵詞，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選藥對活性成分及作用靶點，篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。

1.3 疾病RA 相關(guān)靶點的檢索以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)靶點，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4 藥物-疾病共同靶點預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將所得的藥物靶點與疾病靶點相匹配，篩選出交集靶點。通過Cytoscape 分析上述所有信息，構(gòu)建“疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和相關(guān)靶點篩選將疾病與藥物的交集靶標(biāo)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscae 軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建疾病、藥物靶標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測靶標(biāo)蛋白相互作用關(guān)系。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析利用String 數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病的共同靶點基因進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 信號通路富集分析，并通過R 語言繪制條形圖和氣泡圖，根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度。

1.7 核心有效成分與核心靶點的分子對接將“疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的基因靶點Degree進(jìn)行降序排列，篩選出威靈仙-牛膝藥對前5 位有效成分及核心靶點，在RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫中選擇相應(yīng)基因靶點蛋白結(jié)構(gòu)并下載，在TCMSP及Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的結(jié)構(gòu)并下載，再用Open Babel轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的文件格式。通過Auto Dock軟件將靶點蛋白和小分子配體進(jìn)行對接處理，Pymol進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 威靈仙-牛膝藥對活性成分及靶點的篩選TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出威靈仙有效成分7 個，其中4 個無對應(yīng)靶點予以剔除；牛膝有效成分20 個，其中3 個無對應(yīng)靶點予以剔除。共得到威靈仙-牛膝藥對活性成分19 個（見表1，其中β-谷甾醇為兩藥的共同活性成分），對應(yīng)靶點94個。

表1 威靈仙-牛膝活性成分

2.2 威靈仙-牛膝藥對治療RA 關(guān)鍵靶點的篩選采用GeneCards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索RA相關(guān)靶點，uniprot 進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，共得到疾病靶點基因5589個，匹配藥物靶點與疾病靶點，篩選出交集靶點72個。

2.3 藥物-疾病相關(guān)靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將所篩選的活性成分及相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1），并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析。該圖共有109 個節(jié)點，652 條邊。三角形節(jié)點代表RA，菱形節(jié)點代表威靈仙-牛膝，六邊形節(jié)點代表有效活性成分，八邊形節(jié)點代表靶點，邊線代表藥物、疾病、有效活性成分與靶點之間的相互關(guān)聯(lián)，圖形大小與節(jié)點數(shù)量呈正相關(guān)。根據(jù)Degree值高低篩選出前10個核心有效成分(見表2)以及前30個靶點基因（見表3）。結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素為節(jié)點值較高的活性成分，說明其在治療RA中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

表2 威靈仙-牛膝核心有效成分

表3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中核心靶點基因

圖1 “疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析交集靶標(biāo)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),并分析結(jié)果，預(yù)測靶標(biāo)蛋白相互作用關(guān)系。其中包含82 個節(jié)點，1974 條邊，節(jié)點顏色深淺與節(jié)點數(shù)目呈正相關(guān)。使用Cytoscape 軟件處理數(shù)據(jù)（見圖2）并根據(jù)Degree值高低篩選出前20個核心靶點基因（見表4）。

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點基因

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.5 GO 分析和KEGG 通路分析應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫將篩選出來的威靈仙-牛膝藥對和RA 的共同靶點72 個，進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，共得到生物過程238 條。其中GO 分析得到106條，前20條結(jié)果如圖3所示，主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子（transcription coregulator binding）、泛素樣蛋白連接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）等過程。KEGG 分析得到132 條，前20 條與RA 密切相關(guān)的通路如圖4所示，圓點越大顏色越深，提示該通路富集的靶點越多，P值越小，富集的信號通路與RA 相關(guān)的主要涉及PI3K-Akt 信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPKsignaling pathway）、p53 通路（p53 signaling pathway）等。

圖3 核心靶點的GO分析

圖4 核心靶點的KEGG分析

2.6 核心有效成分與核心靶點的分子對接根據(jù)“疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中交集靶點的Degree 值選擇威靈仙-牛膝藥對核心活性成分槲皮素、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素、β-谷甾醇與核心靶點CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA進(jìn)行分子對接，其中槲皮素、山柰酚與核心靶點CASP3、CCND1 具體對接過程見圖5。對接結(jié)果說明威靈仙-牛膝中活性成分與RA關(guān)鍵核心靶點基因有著良好的結(jié)合作用。

圖5 核心有效成分與核心靶點的分子對接

3 討論

RA以侵蝕性、對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，基本病理改變?yōu)榛ぱ?，血管翳形成，逐漸出現(xiàn)軟骨和骨的破壞，造成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前中藥治療RA 取得良好療效，威靈仙-牛膝則為臨床中的典型藥對，但是有關(guān)其作用機(jī)制及靶點的研究尚不清楚。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病提倡“人體即一個整體”以及“天人合一”，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，探索網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點生物功能與疾病的互作關(guān)系，這與中醫(yī)的整體觀不謀而合。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為中醫(yī)藥藥理基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究的熱門工具，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分篩選、藥物重定位、中藥配伍機(jī)制探索及中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的作用機(jī)制闡釋等。

本研究運用Cytoscape 軟件，構(gòu)建“疾病-藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素為威靈仙-牛膝藥對治療RA的有效活性成分。槲皮素在治療RA 方面取得了良好的臨床療效[7]，可以抑制滑膜血管翳的形成，抑制中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（NETS）的形成，通過抑制NF-κB通路，抑制金屬蛋白酶MMP-13的表達(dá)，減少IL-6等炎癥因子的釋放，改善關(guān)節(jié)腫脹，達(dá)到治療RA 的目的[8]。山柰酚可通過下調(diào)miR-146a，沉默Decorin，使PI3K/AKT/mTOR 通路處于過表達(dá)狀態(tài)，從而達(dá)到抗骨關(guān)節(jié)炎的作用，其還可通過抑制脂多糖（LPS），降低Caspase-1和Caspase-3 的活化水平，減少促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α 的釋放，從而減輕炎癥損傷[9]。黃芩素對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠（CIA）有一定治療作用，可以減輕滑膜增生、延緩骨質(zhì)破壞和降低外周血中炎癥因子釋放[10]。漢黃芩素可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（RA-FLS）的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，通過下調(diào)促炎因子IL-6，降低VEGF 的表達(dá)水平，抑制血管翳的形成，減輕關(guān)節(jié)破壞[11]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，前十位的核心靶點基因為CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA、MYC、IL-6、EGF、ESR1、PPARG。目前研究發(fā)現(xiàn)，Caspase3抑制劑可阻斷TNF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的焦亡，有效緩解CIA 小鼠模型的關(guān)節(jié)炎[12]。上調(diào)lncRNA GAS5，可抑制PI3K/AKT信號通路的活化水平，增強(qiáng)caspase-3、caspase-9 的表達(dá)，抑制RA-FLS 的增殖，減輕關(guān)節(jié)炎癥[13]。TP53除了是一種腫瘤抑制因子外，還是一種炎癥抑制因子，涉及多個細(xì)胞生物過程，與自身免疫性疾病密切相關(guān)。MDM2為TP53的關(guān)鍵調(diào)控因子，在RA-FLS 中高表達(dá)，可通過MAPK 和NF-κB 信號通路影響TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)，其抑制劑具有抗炎活性，可能成為治療RA 的新靶點[14]。CCND1的過表達(dá)可以抑制軟骨細(xì)胞自噬，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞增殖，主要作用機(jī)制包括SN?HG16調(diào)控的microRNA-93-5p/CCND1 軸[15]、cir?cRHOT1 調(diào)控的miR-142-5p/CCND1 軸[16]等。目前研究發(fā)現(xiàn)，MDM2del1518 變異與RA 之間存在相關(guān)關(guān)系[17]。HIF1A 是一種缺氧誘導(dǎo)因子，主要依賴的糖酵解途徑協(xié)調(diào)TH17和Treg細(xì)胞分化，HIF1A的缺失，可下調(diào)TH17，上調(diào)Treg，保護(hù)小鼠免受自身免疫性神經(jīng)炎癥[18]。VEGF 的表達(dá)主要受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、炎癥因子等的影響，通過降低IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，可抑制VEGF 的過表達(dá)，抑制滑膜血管翳的形成，治療RA[19]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGE 的水平與RA 發(fā)病密切相關(guān)，可作為評估RA疾病活動新標(biāo)志物[20]。IL-6在RA的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，使成骨與破骨細(xì)胞之間的平衡失調(diào)，誘發(fā)骨質(zhì)疏松[21]。靶向IL-6慢病毒介導(dǎo)RNA 干擾的體外、體內(nèi)試驗，在CIA 模型中取得良好療效，可作為RA的新型靶向基因治療[22]。

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，威靈仙-牛膝藥對通過DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶II 特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子等實現(xiàn)分子功能，其作用信號通路與PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路及p53 信號通路最為相關(guān)。其中，PI3K/Akt 信號通路通過刺激促炎因子釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡失衡，使RA-FLS 出現(xiàn)異常增殖[23]，研究表明其對滑膜炎癥以及骨破壞也有一定的影響[24]。p38 MAPKs信號通路與RA 滑膜細(xì)胞密切相關(guān)，其抑制劑能夠通過抑制IL-1、IL-6 及TNF-α 等促炎因子的釋放[25]。MiR-143-3p 抑制劑能降低Ras、p-p38 的表達(dá)，抑制Rasp38 MAPKs 通路的活化水平[26]。研究發(fā)現(xiàn)，Triad1 可能通過p53信號通路誘發(fā)RA-FLS的凋亡[27]。

采用分子對接技術(shù)將威靈仙-牛膝藥對活性成分槲皮素、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素、β-谷甾醇與核心靶點蛋白CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA 進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測，結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚等成分與CASP3、CCND1 等核心靶點蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力，說明威靈仙-牛膝藥對RA有一定的治療作用。

因此，可以推斷威靈仙-牛膝可以通過槲皮素、山柰酚、黃芩素、漢黃芩素等活性成分，調(diào)節(jié)CASP 3、TP 53、CCND 1、HIF1A、VEGFA、IL-6 等靶點基因表達(dá)，影響PI3K-Akt、MAPK 及p 53 信號通路等的活化水平，抑制促炎因子的釋放，改善滑膜炎癥與骨破壞，從而發(fā)揮治療RA的作用。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)為基礎(chǔ)，闡明了威靈仙-牛膝藥對通過多成分、多靶點、多通路治療RA 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床試驗及治療提供新思路，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性還有待于體內(nèi)、外試驗的驗證。