王焰，胡磊，閆玉辰，張?zhí)?，陳俊，查云飛

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為主要特點的慢性代謝性疾病。長期患有1型和2型糖尿病的患者可能會出現(xiàn)骨質疏松、骨質減少、骨關節(jié)病變和低應力骨折的風險增加[1-2]。研究表明糖尿病骨病可能是一種慢性骨髓微血管并發(fā)癥[3]。Hu等[4]研究結果顯示基于藥代動力學模型的動態(tài)對比增強MRI(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)和非對稱回波的最小二乘估算法迭代水脂分離方法(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetrical and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)序列可用于定量評估四氧嘧啶誘導的糖尿病兔椎體微血管通透性和椎體脂肪沉積的變化。

紋理分析是影像組學的重要組成部分，是圖像中局部不規(guī)則而宏觀有規(guī)律的灰度特性，對區(qū)域內(nèi)部灰度級變化的特征進行量化。近年來紋理分析在骨病變以及腫瘤的預測、診斷和鑒別診斷、療效評估及預后等方面均顯示出較大應用價值[5]。

代謝組學作為一種研究生物系統(tǒng)內(nèi)小分子代謝物的新興技術，揭示了常規(guī)研究方法無法發(fā)現(xiàn)的疾病發(fā)生發(fā)展的差異代謝通路及潛在的生物標志物，為早期有效控制疾病發(fā)生提供了新的靶點[6]。目前尚未見基于DCE-MRI容量轉移常數(shù)(volume transfer constant，Ktrans)圖紋理分析和代謝組學聯(lián)合評價糖尿病骨髓微血管病變的研究報道，本研究旨在探索基于DCE-MRI Ktrans圖紋理分析和代謝組學的整合生物標志物評價糖尿病早期骨髓微血管病變的可行性。

材料與方法

1.兔糖尿病模型的制備

本研究經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會審查通過。28只3月齡健康日本雄性大耳白兔由武漢大學動物實驗中心提供，平均(3.2±0.2) kg。所有兔經(jīng)過1周適應性飼養(yǎng)，測量空腹血糖均在正常水平。28只兔隨機分為糖尿病組14只，對照組14只。糖尿病組兔的造模方法同Hu等[4]研究一致。單次血糖值大于14 mmol/L或2次血糖值大于11 mmol/L，認定造模成功[7]。48 h后血糖值仍處于正常范圍的糖尿病組兔補加50 mg/kg四氧嘧啶，直到血糖值達到上述標準。4周以后兩組兔血糖水平趨于穩(wěn)定，每次行MRI檢查前測量其血糖值。

2.MRI成像及后處理

實驗兔在第0、4、8、12、16周從耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，擺放體位呈仰臥位、足先進，在3.0T MRI設備(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare，Milwaukee)上固定8通道膝關節(jié)專用相控陣線圈，掃描序列及參數(shù)：常規(guī)腰椎矢狀面FSE-T1WI：TR 300 ms，TE 12 ms，翻轉角142°，層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×288；FSE-T2WI：TR 2500 ms，TE 120 ms，翻轉角142°，層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×320；DCE-MRI：采用肝臟快速容積采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA) 及陣列空間敏感編碼技術(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)，TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，翻轉角6°，9°，12°，層厚3 mm，視野20 cm×20 cm，矩陣192×192，首先行多翻轉角(6°、9°、12°)LAVA序列掃描，掃描3個時相，隨后行動態(tài)增強LAVA序列掃描(翻轉角為12°)。在基線掃描3個動態(tài)時相之后采用雙筒高壓注射器經(jīng)兔耳緣靜脈注射釓雙胺，劑量0.2 mmol/kg，流率為1.0 mL/s，隨后以相同流率注射5 mL 0.9%生理鹽水沖管。

將DCE-MRI原始數(shù)據(jù)導入Omni-Kinetics(GE Healthcare)軟件進行分析。選取最亮一期腰椎中心層面圖像，在腰5-7椎體手動勾畫感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，避開椎間盤、終板、椎基靜脈叢、腦脊液，采用藥代動力學Extended Tofts Linear雙室模型得到Ktrans圖，自動提取76個紋理特征，包括灰度直方圖特征、灰度共生矩陣特征以及灰度游程矩特征。由兩名有3年(醫(yī)師A)和5年(醫(yī)師B)以上骨肌 MR診斷經(jīng)驗、對分組不知情的影像診斷醫(yī)師進行上述所有測量，獲得的數(shù)據(jù)取平均值進行分析(圖1)。采用組內(nèi)相關系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC)評估醫(yī)師A和醫(yī)師B之間的一致性，1個月后醫(yī)師A對全部病變再次勾畫ROI，計算觀察者內(nèi)ICC。

圖1 a)第16周糖尿病組FSE-T1WI圖；b)FSE-T2WI圖；c)DCE-MRI圖，紅色區(qū)域為手動勾畫出的腰椎ROI；d)Ktrans圖。

3.兔腰椎骨髓樣品采集

在第16周完成檢查后，經(jīng)耳緣靜脈注入100 mg/kg戊巴比妥鈉對所有實驗兔實施安樂死。取腰5、6椎體做病理學檢查；取腰7椎體壓碎取出骨髓液氮速凍，-80℃保存做液相色譜-質譜聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS)代謝組學。

4.兔腰椎骨髓代謝組學LC-MS檢測

本次實驗的分析儀器為Ultimate 3000超高效液相串聯(lián)Q Exactive(Thermo Fisher Scientific，USA)高分辨質譜儀組成的液質聯(lián)用系統(tǒng)。將2 μL經(jīng)過前處理的樣本上樣至保持在35℃的AQ C18色譜柱(150×2.1 mm 1.8 um，Utimate)。然后在含0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸胺的乙腈/水(3：2)溶液(A液)和含0.1%甲酸、10 mmol/L 乙酸胺的異丙醇/乙腈(9：1)溶液(B液)的正離子模式流動相中以0.3 mL/min的恒定流速洗滌色譜柱。質譜條件：掃描模式負離子掃描模式；檢測方式Full mass/dd-MS2；分辨率70000(Full mass)；17500(dd-MS2)；電噴霧電壓2.8 kV；毛細管溫度320℃；鞘氣流速40 Arb；霧化器溫度350℃。

5.兔腰椎骨髓病理學檢查

采用10%多聚甲醛固定腰5、6椎體，脫鈣兩周后，石蠟包埋，沿椎體短軸位作4 μm切片，行CD34免疫組化染色。免疫組化染色測量組織內(nèi)微血管密度(microvessel density，MVD)的方法：CD34表達于血管內(nèi)皮細胞，以血管內(nèi)皮細胞的胞質內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。在光學顯微鏡下拍片，同一研究者隨機選取3個相互不連續(xù)區(qū)域，然后在200倍光鏡下計數(shù)染色呈陽性的血管數(shù)，測量結果的平均值作為MVD值。

6.統(tǒng)計學分析

第16周基于Ktrans圖的紋理分析數(shù)據(jù)首先通過ANOVA或Mann-WhitneyU檢驗評估兩組紋理參數(shù)的差異，對剩余的紋理特征進行單因素Logistic回歸分析篩選出有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)特征值。

采用Analysis Base File Converter將LC-MS原始數(shù)據(jù)轉換成通用(adf)格式。在MSDIAL軟件平臺下，進行峰的識別、保留時間校正等預處理，得到一個負離子模式下代謝物名稱、質荷比等的可視化矩陣。通過主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)識別和分析糖尿病組和對照組骨髓代謝輪廓的整體差異。對PLS-DA結果進行交叉驗證，以R2和Q2值作為驗證模型質量的標準。分別計算每個代謝物的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值和變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)值。選擇VIP>1和FC>2或FC<0.5的代謝物進一步進行功能分析。采用R studio軟件(版本4.0.3)，通過富集分析和拓撲分析進行通路分析，識別糖尿病組顯著差異的代謝通路及差異代謝物。

采用Spearman相關性系數(shù)評估MVD、差異代謝物水平與基于Ktrans圖紋理分析特征值的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 a、b)分別為PCA圖和PLS-DA圖，表明糖尿病組(Dg：綠色小圓形和綠色橢圓)和對照組(Cg：紅色小圓形和紅色橢圓)代謝譜具有分開趨勢；c)火山圖顯示所有代謝物和差異代謝物的分布，橫軸是log2(FC)，縱軸是-log10(P)，每一個點代表一個代謝物。

表1 第16周基于DCE-MRI Ktrans圖紋理參數(shù)特征值的單因素Logistic回歸結果

表2 差異代謝物確定的富集代謝通路

結 果

在實驗期間3只糖尿病兔因麻醉意外、健康狀況差死亡，1只血糖恢復正常；對照組因健康狀況差死亡2只，2只實施安樂死。

1.基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理分析

各序列紋理特征測量值的觀察者間及觀察者自身ICC為0.80～0.92(P< 0.01)，表明一致性良好。第16周基于Ktrans圖的紋理參數(shù)共有76個，通過ANOVA和Mann-WhitneyU檢驗篩選出25個特征；對剩下的25個特征進行單因素Logistic回歸分析進一步篩選，篩選出9個特征(表1)。

2.腰椎骨髓代謝組學分析

對所有實驗兔腰7椎體骨髓進行LC-MS分析，PCA圖、PLSDA圖顯示糖尿病組和對照組具有分開趨勢(圖2)。結果顯示PLS-DA模型的R2值為80%，Q2值為10%。本研究基于VIP>1和FC>2或FC<0.5篩選出36種差異代謝物。通過富集分析和拓撲分析進行通路分析，識別糖尿病組顯著差異的代謝通路。相關代謝通路有11條(表2)，其中具有顯著差異的代謝通路為亞油酸代謝通路，主要包括5個差異代謝物，4個磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines，PC) 和1個脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)，分別是PC 14:0～16:0、PC 15:0～18:1、PC 18:0～20:2、PC 18:1～20:1、FA 18:2。

圖3 a)對照組兔腰椎骨髓CD34染色(×200)；b)糖尿病組兔腰椎骨髓CD34染色示微血管(箭)減少(×200)。

3.組織病理學

CD34免疫組化檢查顯示第16周糖尿病組腰椎骨髓的MVD較對照組明顯減少(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.785，P<0.01)。

4.相關性分析

相關性分析結果顯示Median Intensity、Quantile50、Quantile75與MVD呈負相關(r=-0.504，P=0.023；r=-0.490，P=0.028；r=-0.541，P=0.014)，其余紋理參數(shù)特征值與MVD均無相關性(P均>0.05)。差異代謝物與紋理參數(shù)特征值無相關性(P均>0.05)。

討 論

本研究首次基于DCE-MRI Ktrans圖紋理分析與代謝組學整合評價糖尿病兔早期骨髓微血管病變。基于第16周DCE-MRI Ktrans圖篩選出紋理參數(shù)特征值有9個。糖尿病早期骨髓微血管病變與脂質代謝紊亂有關，主要與亞油酸代謝有關。Median Intensity、Quantile50、Quantile75與MVD呈負相關，差異代謝物與紋理參數(shù)特征值無顯著相關關系。

第16周基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理分析結果顯示糖尿病組和對照組有統(tǒng)計學差異的紋理參數(shù)有Median Intensity、Mean Deviation、Quantile50、Quantile75、Quantile95、RMS、sum Average、difference Entropy、Mean Value，說明基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理參數(shù)反映了糖尿病骨早期骨髓細微結構變化。Median Intensity、Quantile50、Quantile75與MVD呈負相關，表明骨髓微血管病變影響到骨髓細微結構，導致了骨髓紋理參數(shù)值出現(xiàn)變化，與楊柳等[8]研究結論一致。此外有研究證明基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理分析可識別糖尿病早期骨骼肌微結構變化[9-10]，說明基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理分析是識別糖尿病骨肌病變的有力工具。

已有研究發(fā)現(xiàn)亞油酸代謝異常與糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病有關[11-12]，糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病屬于糖尿病微血管病變。Hu等[4]采用IDEAL-IQ技術研究顯示糖尿病兔椎體骨髓脂肪含量在第16周顯著增加，目前尚未見糖尿病骨髓微血管病變脂肪酸改變的研究報道。本研究首次揭示了糖尿病早期骨髓微血管病變與脂質代謝紊亂有關，主要與亞油酸通路改變有關。亞油酸屬于多不飽和脂肪酸。早前已有研究證實糖尿病脂質代謝紊亂導致的高膽固醇、高甘油三酯血癥以及多不飽和脂肪酸成分變化可通過損害內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能引發(fā)內(nèi)皮功能障礙[13-14]。內(nèi)皮功能失調是糖尿病多個靶器官微血管病變并發(fā)癥發(fā)生和進展的中心環(huán)節(jié)[15-16]。此外Bellissimo等[17]通過血漿LC-MS研究發(fā)現(xiàn)與脂肪酸代謝相關的通路，尤其是亞油酸相關代謝通路與骨密度顯著相關?；ㄉ南┧崾莵営退岬拇x產(chǎn)物，是促炎類花生酸的的主要前體[18-20]，通過前列腺素E2誘導人骨髓破骨細胞形成和骨吸收[21]。亞油酸衍生的氧化脂類包括9-羥基十八碳二烯酸和13-羥基十八碳二烯酸，是過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑，可促進間充質干細胞向脂肪細胞分化，但不利于成骨細胞分化[22-23]。亞油酸通路相關代謝物可能是糖尿病早期骨髓微血管病變的潛在生物標志物。監(jiān)測亞油酸通路相關代謝物水平可能進一步實現(xiàn)糖尿病早期微血管病變預測和早期診斷。本研究結果顯示糖尿病兔腰椎骨髓差異代謝物與紋理參數(shù)特征值無相關性，可能是不同組學數(shù)據(jù)存在差異性，導致了評估模型的方法不一樣，如何采用高效、有效的整合方法或算法模型對不同組學數(shù)據(jù)進行整合，挖掘多組學數(shù)據(jù)中隱含的信息及規(guī)律是一個亟待解決的問題。

本次研究的局限性：首先，研究樣本量有限，可能會影響紋理分析結果的準確性。其次，本次實驗對象是動物，研究時長為16周，與臨床糖尿病患者慢性代謝性疾病自然病程存在差異。第三，本研究沒有揭示糖尿病早期骨髓微血管病變差異代謝物、基于DCE-MRI Ktrans圖紋理參數(shù)特征值改變的時序性。第四，胰島素對血管的作用也可能導致骨髓微血管的改變，本研究未考慮胰島素對骨髓微血管的影響。

綜上所述，基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理參數(shù)可識別糖尿病早期骨髓細微結構變化，糖尿病早期骨髓微血管病變與脂質代謝有關，主要與亞油酸代謝通路異常有關?；贒CE-MRI Ktrans圖紋理分析和代謝組學整合研究評價糖尿病早期骨髓微血管病變是可行的。