相興偉，邵 婉，舒聰涵，李錦弘，陳 慧，鄧尚貴，周宇芳

（1 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310014 2 浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院 浙江舟山 316021 3 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316022）

人口老齡化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，隨之而來(lái)的骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥已經(jīng)成為世界面臨的公共衛(wèi)生問(wèn)題，目前對(duì)于該病的治療仍是臨床上亟待解決的一大難題。骨是代謝活躍的礦化結(jié)締組織，通過(guò)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成在其整個(gè)生命過(guò)程中不斷重塑[1]。然而，骨重塑失衡會(huì)增加骨吸收，減少骨形成[2]，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，表現(xiàn)為骨量減少和微結(jié)構(gòu)惡化，造成機(jī)體骨折、發(fā)病，最終縮短壽命[3-4]。有效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松和骨折是至關(guān)重要的，因?yàn)楣琴|(zhì)疏松患者可能完全無(wú)癥狀，直到他們經(jīng)歷骨折[5]。骨質(zhì)疏松治療的主要目標(biāo)是通過(guò)調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的平衡來(lái)恢復(fù)骨量。因此，許多科學(xué)家試圖尋找刺激成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞活力的有效化合物和分子[6-7]。成骨細(xì)胞作為骨形成的主要功能單位，只有其不斷的增殖才能產(chǎn)生豐富的膠原基質(zhì)，通過(guò)分化、礦化形成更多骨質(zhì)。促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，改善成骨細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)骨重建，對(duì)防治骨質(zhì)疏松具有積極意義。

目前市面上治療骨質(zhì)疏松的藥物均存在一定的副作用，不僅價(jià)格昂貴，還可能引起其它疾病。尋找副作用少、安全有效的功能性食品來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松成為研究熱點(diǎn)。生物活性肽具有利用率高，易吸收，安全性高等特點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)海洋源活性肽具有抗骨質(zhì)疏松的作用，這為開(kāi)發(fā)預(yù)防骨質(zhì)疏松的功能食品提供了新思路。Oh 等[8]從貽貝中提取抗氧化肽，研究其對(duì)去卵巢（OVX）小鼠的抗骨質(zhì)疏松作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療10周后增強(qiáng)了其骨密度和其它骨參數(shù)，降低了骨鈣素和堿性磷酸酶（ALP）活性。Zhang 等[9]發(fā)現(xiàn)鰱魚(yú)皮膠原肽可以改善骨密度，通過(guò)刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）/Smad 信號(hào)通路，改善膠原與整合素α2 β1 的相互作用來(lái)促進(jìn)骨重塑。Chen 等[10]發(fā)現(xiàn)從牡蠣蛋白水解物中提取的肽，通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2 MAPK 通路提高成骨細(xì)胞活力，同時(shí)增加骨基質(zhì)蛋白，如BPM-2、OPN、OCN 的分泌。

中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis），俗稱紅蝦，在海捕蝦中占有十分重要的地位[11]。其加工過(guò)程中產(chǎn)生大量蝦頭、蝦殼等廢棄副產(chǎn)物。蝦類加工副產(chǎn)物富含多種氨基酸，組成蛋白質(zhì)的氨基酸比例與人體肌肉成分極為接近，可以作為很好的蛋白質(zhì)資源，因此有效利用蝦類加工副產(chǎn)物制備活性肽具有重要意義。蝦肽具有抗氧化[12]、抗骨質(zhì)疏松[13]、降血壓[14]和改善小鼠肝毒性[15]等多種生物學(xué)功能，而其在抗骨質(zhì)疏松方面的研究較少。本文選用蝦肽作為MC3T3-E1 Subclone14 成骨細(xì)胞的受試活性成分，研究其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響，為蝦副產(chǎn)物資源高值化利用提供理論支撐，也為預(yù)防骨質(zhì)疏松功能食品的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦肽，由實(shí)驗(yàn)室自行制備，原料為舟山市越洋食品有限公司提供的紅蝦加工副產(chǎn)物蝦頭和蝦殼；MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清，Biological Industries 公司；胰酶、雙抗、α-MEM 培養(yǎng)基，Thermo Scientific 公司；MTT、β-甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸，美國(guó)Sigma 公司；茜素紅S 染色液，北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；核酸染料，上海天能科技有限公司；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑盒TB GreenRPremix Ex TaqTM，TaKaRa 公司；PBS 溶液、4%多聚甲醛、Trizol，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DEPC 水，上海生工生物工程公司；ALP 試劑盒、OCN 試劑盒、COL-I 試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國(guó)藥試劑分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技有限公司；倒置光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司；倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica Microsystems；Synergy H1 酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek；微量蛋白核酸定量?jī)x，德國(guó)IMPLEN 公司；暗箱四用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技有限公司；雙開(kāi)門(mén)冰箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦肽的制備 紅蝦原料用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，加入95%乙醇按照0.1 g/mL 的質(zhì)量濃度混合，室溫下攪拌脫脂8 h，過(guò)濾，取濾渣，45 ℃烘干，備用。按照0.5 g/mL 的質(zhì)量濃度向?yàn)V渣中加入蒸餾水，pH 值調(diào)至7.2，加入2%堿性蛋白酶，于55 ℃下攪拌酶解5 h，90 ℃滅酶20 min，過(guò)濾取上清。將酶解液通過(guò)0.5 μm 孔徑無(wú)機(jī)陶瓷膜分離。收集透過(guò)液依次通過(guò)1 000 u 和250 u 的超濾膜，收集透過(guò)液和截留液，得到250～1 000 u 組分，冷凍干燥得蝦肽。

1.3.2 成骨細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存管從液氮罐中取出，放入37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，快速搖動(dòng)使其在1 min 內(nèi)完全解凍，待完全融化后，取出凍存液到入裝有完全培養(yǎng)基（血清：α-MEM 培養(yǎng)基：雙抗比例為9∶1∶0.1） 的離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清。加入PBS 后吹打混勻，1 000 r/min 速度下離心5 min，緩慢棄上清，重復(fù)上述操作2 次。棄去上清后，加入完全培養(yǎng)基，吹打混勻，轉(zhuǎn)移到T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層，數(shù)量占整個(gè)視野內(nèi)的90%以上，進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中原有培養(yǎng)液，加入PBS 輕柔吹打細(xì)胞3 次，棄去PBS 后，加入1 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化1～2 min，鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收縮成圓形尚未浮起時(shí)，加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吹打培養(yǎng)瓶底，使細(xì)胞脫離瓶底。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min 離心5 min 去上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸。將重懸的細(xì)胞懸液按比例重新轉(zhuǎn)移至新的T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3.3 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中，每孔100 μL，邊緣孔加入PBS，放入培養(yǎng)箱孵育。第2天上午，棄去培養(yǎng)液，對(duì)照組加入100 μL 完全培養(yǎng)液，其余組分別加入100 μL 含質(zhì)量濃度分別為0.02，0.05，0.1 mg/mL SP 的完全培養(yǎng)液，每組6個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，每孔各加入10 μL 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO溶液，輕輕振蕩混勻。在酶標(biāo)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

式中，A0——空白組吸光度；A1——對(duì)照組吸光度；A2——樣品組吸光度。

1.3.4 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響 為考察MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞的分化能力，采用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有10 mmol/L β-甘油磷酸鹽和50 μg/mL 抗壞血酸的完全培養(yǎng)基。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，每孔1 mL。24 h 后，更換質(zhì)量濃度為0，0.02，0.05，0.1 mg/mL 的蝦肽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞每隔3～4 d 更換1 次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化3，7 d 和14 d。待培養(yǎng)結(jié)束后，收集上清液裝入EP 管中，1 500 r/min 離心10 min，取上清-20 ℃保存待用。

將培養(yǎng)3 d 和7 d 的細(xì)胞培養(yǎng)液上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)在酶標(biāo)板上進(jìn)行加樣，加樣完畢后輕輕振蕩混勻，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)定各孔吸光度值。ALP 活力按式（2）計(jì)算。

將培養(yǎng)7 d 和14 d 的細(xì)胞上清液按照OCN、COL-I 試劑盒說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，每孔1 mL。24 h 后，更換為含質(zhì)量濃度0，0.02，0.05，0.1，0.2 mg/mL 的蝦肽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞每隔3～4 d 更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化21 d。培養(yǎng)結(jié)束后吸走培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 輕柔洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，棄去固定液，超純水洗3 次，將水完全吸干凈后，慢慢加入茜素紅S 染液，室溫染色20～30 min，棄去染料，超純水洗3 次，每孔加入適當(dāng)超純水，在低倍鏡視野（×40）下隨機(jī)選取8 個(gè)視野，用Image J 對(duì)礦化結(jié)節(jié)面積進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響 在24 孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔5×104個(gè)，放入培養(yǎng)箱孵育24 h 后，除對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液外，其余試驗(yàn)組加入含不同濃度SP 的完全培養(yǎng)液孵育72 h。然后，用預(yù)冷PBS 清洗3 遍后，棄去PBS，加入1 mL 預(yù)冷TRIzol 試劑，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，通過(guò)Genebank 檢索得到目的基因mRNA 序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合適引物，委托上海生工生物工程公司合成，按TRIzol 試劑法提取細(xì)胞總RNA。用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)OD A260/A280、OD A260/A230及RNA 濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA 的純度。檢測(cè)后的總RNA 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa 公司的熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)。熒光的采集與溶解曲線的制作按照熒光定量PCR 儀的說(shuō)明進(jìn)行。每個(gè)樣品靶基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)水平用2-△△Ct計(jì)算，以β-actin 為內(nèi)參基因。

表1 RT-PCR 反應(yīng)引物序列Table 1 Primer sequence of Real-Time PCR

1.3.7 對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL、RUNX2 基因mRNA 表達(dá)水平的影響 按1.3.6 節(jié)方法檢測(cè)蝦肽對(duì)MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞OPG、RANKL、RUNX2 基因mRNA 的表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表2。

表2 RT-PCR 反應(yīng)引物序列Table 2 Primer sequence of Real-Time PCR

1.3.8 對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL、RUNX2 蛋白表達(dá)水平的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)密度接種于6 孔板中，在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。除對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液外，其余試驗(yàn)組加入含不同質(zhì)量濃度蝦肽的完全培養(yǎng)液孵育72 h。然后用胰酶消化，收集細(xì)胞于1.5 mL 離心管中，每個(gè)離心管中加入40 μL RIPA 細(xì)胞裂解液，吹打數(shù)次，置冰上裂解15 min。然后用離心機(jī)12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，取上清液。利用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將每個(gè)樣品的蛋白濃度調(diào)至相同，按比例加入Loading buffer，100 ℃煮沸10 min，4 000 r/min 離心5 min 取上清，將上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶常溫孵育1 h，用一抗在一定比例下4 ℃振蕩孵育過(guò)夜，再與二抗室溫振蕩孵育1 h，使用碧云天BeyoECL Star（特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒）顯影，將膜置于顯影液中，使用化學(xué)發(fā)光成像儀，觀察條帶，并拍照分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-way-ANOVA）進(jìn)行多組比較。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：P ＜0.05 表示差異顯著；P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響

成骨細(xì)胞的成熟經(jīng)歷了增殖、分化和礦化3個(gè)階段。首先采用MTT 法檢測(cè)SP 對(duì)MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞增殖活性的影響。如圖1所示，與對(duì)照組相比，SP 對(duì)細(xì)胞存活沒(méi)有顯著抑制作用，說(shuō)明蝦肽對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有毒性。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，SP 質(zhì)量濃度在0.02～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)，顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖，采用質(zhì)量濃度為0.05，0.1 mg/mL 的蝦肽處理24 h 后，其細(xì)胞增殖率分別為130.04%±3.80%（P ＜0.001），115.34%±0.76%（P ＜0.05），細(xì)胞用0.02，0.05 mg/mL 的蝦肽處理48 h 后，其增殖率分別為117.73%±3.88%（P ＜0.01），115.88%±3.71%（P ＜0.01），蝦肽處理72 h 后，質(zhì)量濃度為0.02～0.1 mg/mL 各組細(xì)胞增殖率有所增加，無(wú)顯著性差異。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.1 mg/mL，細(xì)胞增殖率降低，整體上SP 在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 和1 mg/mL 時(shí)，抑制了不同時(shí)間段細(xì)胞增殖。故選取0.02，0.05，0.1 mg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 蝦肽對(duì)MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 The effect of SP on proliferation rate of MC3T3-E1 Subclone14 cells

2.2 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞ALP 活力、OCN 和COL-I含量的影響

成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Subclone 14 的分化是一個(gè)時(shí)間漸進(jìn)性過(guò)程，考察0，0.02，0.05，0.1 mg/mL 質(zhì)量濃度下，不同分子質(zhì)量蝦肽與誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基共同作用3 d 和7 d 后，對(duì)成骨細(xì)胞ALP 活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2a。蝦肽處理3 d 后，與對(duì)照組相比，SP 各濃度組ALP 活力分別顯著提高了（33.33±0.64），（36.07±7.15），（25.44±11.75） U/L （P ＜0.05）；蝦肽處理7 d 后，SP 各質(zhì)量濃度組ALP 活力分別顯著提高了 （12.88±4.28），（18.04±4.25），（15.19±1.73） U/L （P ＜0.05）。蝦肽各濃度組間ALP 活力無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。

不同時(shí)期低分子質(zhì)量蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞OCN和COL-I 含量的影響如圖2b-2c 所示。SP 干預(yù)7 d 時(shí)，與對(duì)照組相比，OCN 的含量有所增加，無(wú)顯著性差異，SP 干預(yù)14 d 時(shí)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.02，0.1 mg/mL 時(shí)，OCN 含量顯著提高了（205.28±49.21），（132.87±33.42） ng/L（P ＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL 時(shí)，OCN 含量有所提高，無(wú)顯著性差異。SP 干預(yù)7 d，在0.02～0.1 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，COL-I 含量分別顯著提高了（10.90±2.47），（8.86±1.13），（6.26±0.26）ng/mL （P ＜0.05），SP 干預(yù)14 d 時(shí)，COL-I 含量分別顯著提高了 （11.41±1.78），（11.45±3.14），（10.58±1.30）ng/mL。SP 干預(yù)7 d 時(shí)，COL-I 含量隨濃度升高而緩慢降低。

圖2 不同時(shí)期蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞ALP（a）、OCN（b）和COL-I（c）含量的影響Fig.2 Effects of SP in different periods on ALP （a），OCN （b） and COL-I （c） content of osteoblasts

2.3 不同時(shí)期蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響

礦化基質(zhì)的形成是成骨細(xì)胞分化末期的決定性標(biāo)志，也是成骨能力的體現(xiàn)。當(dāng)成骨細(xì)胞分化到一定階段，其細(xì)胞表層的外基質(zhì)會(huì)形成鈣離子螯合物，這一螯合物就是礦化結(jié)節(jié)。利用茜素紅染料與基質(zhì)中的Ca2+耦合形成一種紅色化合物，通過(guò)觀察礦化結(jié)節(jié)的形成能直接反應(yīng)出成骨細(xì)胞分化能力。蝦肽處理分化誘導(dǎo)21 d 后，茜素紅染色和礦化結(jié)節(jié)面積的結(jié)果分別如圖3和圖4所示。通過(guò)茜素紅染色，產(chǎn)生了桔紅色沉積，此即為礦化結(jié)節(jié)，與對(duì)照組相比，SP 所有試驗(yàn)組的礦化結(jié)節(jié)面積相對(duì)于對(duì)照組增加了7.03%±2.61%，8.74%±1.70%，20.54%±2.33%（P ＜0.05），礦化結(jié)節(jié)面積隨SP 濃度增加而增大，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

圖3 不同組的茜素紅染色圖Fig.3 Images of alizarin red staining in different groups

圖4 不同組的礦化結(jié)節(jié)面積Fig.4 Mineralized nodule area in different groups

2.4 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響

檢測(cè)了不同濃度SP 對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因ALP、OCN 和COL-I 表達(dá)量的差異，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組均能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，ALP 和COL-I 的基因表達(dá)量分別顯著提高了0.78±0.16 和1.33±0.18 （P ＜0.05），在0.02，0.05 mg/mL 質(zhì)量濃度下，對(duì)ALP 和OCN 的基因表達(dá)量提高效果較好，OCN 的基因表達(dá)量均有所提高，無(wú)顯著性差異。

圖5 蝦肽對(duì)成骨細(xì)胞ALP（a）、OCN（b）、COL-I（c）mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SP on ALP（a），OCN（b） and COL-I（c） mRNA expression in osteoblasts

2.5 蝦肽對(duì)OPG、RANKL、RUNX2 基因mRNA表達(dá)水平的影響

進(jìn)一步通過(guò)QPCR 法檢測(cè)低分子質(zhì)量蝦肽對(duì)MC3T3-E1 Subclone14 細(xì)胞OPG、RANKL 以及RUNX2 基因mRNA 表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)SP 質(zhì)量濃度為0.02，0.05 mg/mL 時(shí)，顯著提高了OPG、RUNX2 基因mRNA 表達(dá)水平，分別提高了2.08±0.34，2.94±0.16 和1.05±0.20，0.97±0.20（P ＜0.05），在0.1 mg/mL 時(shí)，無(wú)顯著性差異；與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組RANKL 基因mRNA 表達(dá)水平均有所降低，SP 在0.02 mg/mL 時(shí)，對(duì)RANKL 基因mRNA 表達(dá)的抑制作用有顯著性，降低了0.67±0.01（P ＜0.05）。

圖6 蝦肽對(duì)OPG（a）、RANKL（b）、RUNX2（c）基因mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of SP on mRNA expression of OPG （a），RANKL （b） and RUNX2 （c） genes

2.6 蝦肽對(duì)OPG、RANKL、RUNX2 蛋白表達(dá)水平的影響

選取質(zhì)量濃度為0.02，0.05 mg/mL 效果較明顯的兩組，利用Western Blot 法進(jìn)一步檢測(cè)低分子質(zhì)量蝦肽對(duì)OPG、RANKL 以及RUNX2 蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖7所示。與對(duì)照組相比，SP 質(zhì)量濃度為0.02，0.05 mg/mL 時(shí)，OPG 蛋白的表達(dá)水平均顯著提高，分別提高了1.68±0.08，4.14±0.13，RANKL 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，分別降低了0.75±0.09，2.15±0.07，且呈濃度依賴效應(yīng)。這說(shuō)明低分子質(zhì)量蝦肽可能通過(guò)上調(diào)OPG 蛋白表達(dá)和抑制RANKL 蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)OPG/RANKL 的比值，從而激活OPG-RANKL 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞的分化。另外可以發(fā)現(xiàn)，隨著質(zhì)量濃度的升高，SP 顯著提高RUNX2 蛋白的表達(dá)水平，且在質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL 時(shí)效果較好，相比對(duì)照組提高了3.69±0.15（P ＜0.05）。

圖7 蝦肽對(duì)OPG（a）、RANKL（b）、RUNX2（c）蛋白表達(dá)水平的影響Fig.7 Effects of SP on the protein expression of OPG（a），RANKL（b） and RUNX2（c）

3 結(jié)論與討論

本研究以MC3T3-E1 Subclone14 成骨細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，比較了蝦肽對(duì)其增殖、分化和礦化的影響，研究發(fā)現(xiàn)SP 對(duì)成骨細(xì)胞均無(wú)明顯毒副作用，具有較好的增殖活性。ALP、COL-I 和OCN 是成骨細(xì)胞分化和礦化階段的重要標(biāo)志物[16]。此外，成骨細(xì)胞分化涉及成骨基因，如ALP、COL-I 和OCN 的分期特異性表達(dá)，這些基因可用于監(jiān)測(cè)前成骨細(xì)胞向完全成熟細(xì)胞的發(fā)展[17]。這些成骨基因在體外是成骨細(xì)胞分化和骨形成的標(biāo)志[18]。在前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中，首先表達(dá)ALP 基因，然后是COL-I，最后是OCN 基因[19]。堿性磷酸酶（ALP）被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成骨活性早期標(biāo)志的酶，它可以水解單磷酸酯，為礦化過(guò)程提供磷酸鹽，因此，強(qiáng)ALP 活性是成骨細(xì)胞分化早期所必需的。OCN 是最突出的非膠原蛋白，占骨組織有機(jī)基質(zhì)的1.5%。OCN 是在骨形成后期由成熟的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞合成和分泌的，對(duì)骨細(xì)胞外基質(zhì)中羥基磷灰石的結(jié)合和沉積起重要作用[20]。OCN 與成骨和礦化率直接相關(guān)[21]，血清中OCN 水平被認(rèn)為是骨組織形成的標(biāo)志。COL-I 是骨組織中主要的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分子，構(gòu)成了90%～95%的有機(jī)基質(zhì)[22]。對(duì)骨組織結(jié)構(gòu)的完整及維持其生物力學(xué)特性起著非常重要的作用，也是成骨細(xì)胞向基質(zhì)成熟方向分化的標(biāo)志[23]。通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中ALP、OCN、COL-I分泌的含量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)3 d 和7 d 時(shí)，SP 能促進(jìn)ALP 的表達(dá)從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。細(xì)胞培養(yǎng)7 d 和14 d 時(shí)，不同質(zhì)量濃度SP 均能增加OCN、COL-I 分泌的含量?；|(zhì)礦化是誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的最后一步。作為成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志，這一步驟保持了骨形成的完整性。茜素紅染色已廣泛應(yīng)用于礦物沉積的鑒定[24]。用茜素紅染色法研究SP 對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響，可以發(fā)現(xiàn)SP 能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)QPCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP 能通過(guò)上調(diào)ALP、OCN、COL-I 基因的表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞分化。

RUNX2 是決定MC3T3-E1 向成骨細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵調(diào)控因子[25]。當(dāng)成骨細(xì)胞達(dá)到終末分化時(shí)，它們分泌不同的補(bǔ)充骨基質(zhì)的基質(zhì)蛋白，如I 型膠原（COL-I）、骨鈣素（OCN）和堿性磷酸酶（ALP）[26]。COL-I 形成膠原纖維，作為骨組織的支架。ALP 生成磷酸鈣沉積在成熟成骨細(xì)胞中，促進(jìn)骨礦化，而OCN 是參與礦化調(diào)控最豐富的蛋白[27]。本研究顯示，SP 顯著增加了RUNX2 的表達(dá)，說(shuō)明SP 通過(guò)提高RUNX2 轉(zhuǎn)錄觸發(fā)成骨細(xì)胞的分化過(guò)程。其它成骨相關(guān)基因包括ALP、COL-I 和OCN在成骨細(xì)胞分化和成熟的各個(gè)階段也被SP 升高。因此，在成骨細(xì)胞分化和骨形成的所有階段，SP都具有誘導(dǎo)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨的能力。

成骨細(xì)胞通過(guò)OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成來(lái)控制骨吸收。RANKL 通過(guò)與受體RANK 結(jié)合，在破骨細(xì)胞生成的激活中起關(guān)鍵作用[28]。OPG 是成骨細(xì)胞分泌的可溶性蛋白，其與RANKL 結(jié)合，占據(jù)RANK 的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷其作用，因此OPG 是骨吸收的負(fù)調(diào)控因子，作為一種可溶性的RANKL 受體拮抗劑，降低破骨生成[29-30]。多項(xiàng)研究證明，打破RANK、RANKL 和OPG 的平衡會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨骼疾病[31-32]。而RANKL/OPG 比值是成骨細(xì)胞骨與破骨細(xì)胞骨動(dòng)態(tài)平衡決定因素之一，該比值大于1 可保證成骨細(xì)胞骨合成能力處于優(yōu)勢(shì)地位。在本研究中，發(fā)現(xiàn)SP 能促進(jìn)細(xì)胞上清OPG 分泌并抑制RNAKL 分泌，通過(guò)調(diào)節(jié)OPG 和RANKL 的基因和蛋白表達(dá)，從而激活OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路，并促進(jìn)RUNX2在基因和蛋白水平的上調(diào)。這表明SP 通過(guò)下調(diào)RANKL/OPG 的比例來(lái)刺激成骨細(xì)胞的骨形成。

本研究為將蝦肽開(kāi)發(fā)成為一種預(yù)防骨質(zhì)疏松的功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時(shí)也為促進(jìn)蝦加工副產(chǎn)物的充分開(kāi)發(fā)提供有效參考。