趙才冬，漆姚姚，雷楚文，裘樂蕓，鄧澤元，鄭溜豐

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌 330047）

慢性病嚴(yán)重危害人類健康，其中糖尿病已成為全球疾病死亡的主要原因。據(jù)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界糖尿病的患者數(shù)超過4.63 億，其中我國的糖尿病患者超過1.164 億，成為糖尿病第一大國[1]。糖尿病可能引起各種并發(fā)癥，主要是對眼、腎、心臟、血管及神經(jīng)的慢性損害[2]。防治糖尿病刻不容緩。傳統(tǒng)的降血糖藥物多為人工合成的化合物，如α-葡萄糖苷酶抑制劑（阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖），被認(rèn)為是治療糖尿病的一線藥物[3]。然而，現(xiàn)有的治療藥物有許多局限性，會產(chǎn)生包括胃腸和肝臟疾病等各種副作用[4]。近年來，膳食來源的天然化學(xué)物在防治糖尿病中具有重要作用[5]。迫切需要從膳食來源的天然產(chǎn)物庫中探尋高效、低毒，具有降血糖功效的活性分子。

膳食中添加蛋白水解物能夠以不依賴于胰島素的方式，顯著降低餐后血糖水平及改善胰島素敏感性，提示蛋白酶解物中的活性肽具有很好的降血糖作用[6]。除了通過抑制α-葡萄糖苷酶來干擾碳水化合物消化外，減少小腸對葡萄糖的吸收也是治療糖尿病的有效途徑。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要誘因之一[7]?，F(xiàn)有研究表明，活性氧可通過影響葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的表達，促進小腸攝取葡萄糖，而植物化學(xué)物，如白楊素和綠原酸可通過清除活性氧來減少葡萄糖攝取[8-9]。使用抗氧化天然化合物等，被認(rèn)為是糖尿病治療的新方法。

本課題組前期通過木瓜蛋白酶水解甲魚蛋蛋白制備分子質(zhì)量＜2.5 ku 組分，其具有較強的抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性，是潛在的降血糖組分[10]。此外，了解活性肽在胃腸道消化后的活性功效，對于評估其生物活性及生物利用度至關(guān)重要[11]。甲魚蛋＜2.5 ku 組分的胃腸消化特性及其消化后是否仍具有活性功效等問題亟待研究。本研究通過體外模擬胃及胃腸道消化模型，探究甲魚蛋＜2.5 ku 組分的胃腸消化特性、消化前后抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化，為糖尿病的防治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

甲魚蛋凍干粉，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽，Sigma 公司。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

Cr-103 型nh 色差儀，廈門海達儀器有限公司；XW-80A 型渦旋儀，上海滬西分析儀器廠；SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器，上海博迅實業(yè)有限公司；Agilent 1100 系列高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司 （液相色譜柱為Waters XBridg BEH SEC 柱）；FD-1 型冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；pHs-2 酸度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Varioskan Flash 型全自動酶標(biāo)儀、LEGEND MACH 1.6R 型離心機，美國Thermo 公司；Millipore 超濾離心管，上海登寧科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甲魚蛋蛋白水解物＜2.5 ku 降糖組分的制備 甲魚蛋蛋白酶解：用95%乙醇在超聲波水浴下對甲魚蛋凍干粉進行醇沉，離心獲取蛋白質(zhì)[10]。將甲魚蛋蛋白粉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蛋白溶液，選取木瓜蛋白酶（5 000 U/g 蛋白粉）進行酶解，酶解條件是：50 ℃，pH 6.5。用1 mol/L NaOH 或HCl 保持酸堿度恒定。酶解6 h 后在90 ℃下對酶進行20 min 滅活，8 000×g 離心15 min 除沉淀，將上清液冷凍干燥并在-20 ℃下儲存。

超濾：用分子質(zhì)量為10 ku 和2.5 ku 的超濾膜對甲魚蛋蛋白木瓜酶解液超濾分級，得到3 個組分＞10 ku，10～2.5 ku 和＜2.5 ku，并將＜2.5 ku 的組分凍干，用于后續(xù)試驗。

1.3.2 色澤的測定 使用色差儀測定甲魚蛋凍干粉、＜2.5 ku 降糖肽組分的顏色。首先將樣品放在標(biāo)準(zhǔn)白板上（L0*=94.46，a0*=-0.61，b0*=4.64），記錄明亮度L*值、紅綠色調(diào)a*值及藍黃色調(diào)b*值。L*表示顏色變化范圍從黑（0）到白（100），+ΔL*=明亮，-ΔL*=較暗；a*表示顏色變化范圍從紅（+）到綠（-），+Δa*=較紅，-Δa*=較綠；b*表示顏色變化范圍從黃（+）到藍（-）的變化，+Δb*=較黃，-Δb*=較藍。總色差（ΔE*）計算公式：

1.3.3 體外模擬胃腸消化 將＜2.5 ku 組分用去離子水配成1 mg/mL 的溶液。取1 mL 該溶液、1 mL 胃蛋白酶溶液（酶活4 000 U/mL），用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.8，用渦旋儀充分混勻，置于37 ℃100 r/min 的水浴搖床中避光反應(yīng)2 h，收集胃消化液，90 ℃水浴10 min 滅酶。在上述經(jīng)胃消化的體系中繼續(xù)加入2 mL 胰蛋白酶溶液 （酶活200 U/mL），用1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至7，渦旋儀充分混勻后，置于37 ℃100 r/min 的水浴搖床中避光反應(yīng)2 h，收集腸消化液，90 ℃水浴10 min 滅酶。

1.3.4 多肽含量的測定 將＜2.5 ku 組分及其胃腸消化后的樣品配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，取2.5 mL 該溶液，加入2.5 mL 10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置20 min，然后在4 200 r/min 下離心10 min。取1.0 mL 上述溶液，加入雙縮脲試劑3.0 mL（V樣液∶V雙縮脲試劑=3∶2），混合均勻后于60 ℃水浴顯色5 min，4 200 r/min 離心10 min。取上清液于波長310 nm 處測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中多肽質(zhì)量濃度（mg/mL），進而求得樣品中多肽含量。通過谷胱甘肽繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測甲魚蛋蛋白水解物的消化特性 甲魚蛋蛋白水解物、不同分子質(zhì)量組分及＜2.5 ku 組分經(jīng)胃腸消化后的分子質(zhì)量分布采用Agilent 1100 系列高效液相色譜儀測定。其分析條件為：反向液相色譜柱Waters XBridg BEH SEC 柱（3.5 μm，7.8 mm×300 mm），流動相為水∶乙腈=40%∶60%（體積比），柱溫箱溫度30 ℃，DAD 檢測波長214 nm，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，時間20 min。

1.3.6 DPPH 自由基清除能力的測定 將DPPH粉末加入甲醇中制得0.26 mmol/L DPPH 溶液。取100 μL DPPH 溶液與20 μL 樣品加入96 孔板中，室溫避光條件中反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處用全自動酶標(biāo)儀測定其吸光度，平行測定3 次。DPPH 自由基清除率計算公式：

式中，A0——不加樣品，加入DPPH 時的吸光度；Ai——加入樣品和DPPH 的吸光度；Aj——加入樣品，不加DPPH 的吸光度。

1.3.7 ABTS 自由基清除能力的測定 將5 mL 7.4 mmol/L ABTS 儲備液與88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液混勻，暗處靜置12～16 h，配成ABTS工作液。ABTS 工作液用80%乙醇稀釋，使混合溶液在734 nm 波長處的吸光值為0.7。將200 μL ABTS 工作液與20 μL 樣品加入96 孔板中，常溫避光混合6 min，在波長734 nm 處測定吸光度，平行測定3 次。ABTS 自由基清除率計算公式：

式中，A0——不加樣品，加入ABTS 時的吸光度；Ai——加入樣品和ABTS 的吸光度；Aj——加入樣品，不加ABTS 的吸光度。

1.3.8 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 將100 μL 樣品與50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.35 U/mL）混合均勻，在37 ℃孵育20 min。然后，向混合物中加入100 μL 1 mmol/L 對硝基苯基吡喃葡萄糖苷（底物），在37 ℃孵育30 min，然后，加入1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在410 nm 波長處測定吸光度。α-葡糖苷酶抑制活性計算公式：

式中，Acontrol——對照組的吸光度值；Asample——加入樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲魚蛋凍干粉及＜2.5 ku 降糖肽組分的色澤

色澤是影響活性成分在食品中應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，消費者的第一視覺感受影響消費者的選擇[12]，未經(jīng)過處理的原料甲魚蛋凍干粉呈黃色，制備的＜2.5 ku 降糖肽組分的粉末顏色呈黃綠色，粉末較其水溶液為無色透明。如表1所示，制備的＜2.5 ku 降糖肽組分相比于未經(jīng)處理的原料甲魚蛋粉的L*、a*及b*值均有降低，其主要原因可能與蛋白酶的酶解作用有關(guān)，蛋白酶作用于蛋白質(zhì)大分子被切割成小分子肽和氨基酸等，而生成的有色物質(zhì)會使酶解液顏色變深，亮度降低[13]。

表1 甲魚蛋凍干粉及＜2.5 ku 降糖肽組分的色澤Table 1 Colour readings of soft-shelled turtle egg powder and its ＜2.5 ku hypoglycemic peptide fraction

2.2 消化前、后多肽含量的變化

以谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其吸光值與濃度有較強的線性關(guān)系（圖1），線性方程為y=0.0533x+0.0015，相關(guān)系數(shù)為0.9931。可根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液中多肽含量。

圖1 多肽含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of peptide content

前期研究表明，甲魚蛋蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后＜2.5 ku 組分具有潛在的降糖功效[10]?；钚噪脑谖改c道中易被蛋白酶降解，是決定其體內(nèi)功效發(fā)揮的關(guān)鍵[14]。研究表明，胃腸道消化影響肽的生物活性存在雙重性，即增強或降低其活性[15-16]。采用體外模擬胃腸道消化模型，探究甲魚蛋＜2.5 ku降糖肽組分的胃腸消化特性及經(jīng)消化后是否仍有潛在的降糖活性。如圖2所示，經(jīng)胃及胃腸道消化后，＜2.5 ku 組分所產(chǎn)生的肽含量顯著增多（圖2），提示該組分在胃腸道中不穩(wěn)定，可進一步被胃及腸道中的蛋白酶降解產(chǎn)生更短的肽。

圖2 胃及胃腸消化前、后＜2.5 ku 組分的肽含量Fig.2 Peptide contents of ＜2.5 ku fraction before and after gastric and gastrointestinal digestions

2.3 消化前、后的酶解原液及不同分子質(zhì)量組分的液相色譜圖

尺寸排阻色譜是常用的蛋白質(zhì)及肽分子質(zhì)量測定方法。出峰時間越早，肽分子質(zhì)量越大；出峰時間越晚，肽分子質(zhì)量越小[17]。甲魚蛋蛋白水解物、不同分子質(zhì)量組分及＜2.5 ku 組分經(jīng)胃及胃腸消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布見圖3。未消化的甲魚蛋蛋白水解原液中肽的分子質(zhì)量較大，出峰時間集中在7～10 min；而＜2.5 ku 組分中小分子質(zhì)量肽的含量增加，12～17 min 的色譜峰明顯增加，表明采用超濾法制備的＜2.5 ku 組分中肽的分子質(zhì)量符合預(yù)期，主要含小分子質(zhì)量的低聚肽。

圖3 酶解原液及不同分子質(zhì)量組分的液相圖Fig.3 Liquid phase diagram of enzymatic hydrolysate and different molecular weight components

生物活性肽的胃腸道消化特性部分取決于其分子質(zhì)量，通常小分子質(zhì)量的低聚肽不易被消化降解，而大分子質(zhì)量多肽易被消化降解生成更短的肽[18-19]。甲魚蛋＜2.5 ku 組分經(jīng)胃消化后，產(chǎn)物色譜峰的數(shù)量及峰面積變化不大，只在10.38 min 處出現(xiàn)一個新峰（圖4），提示該組分在體外模擬胃消化中未被明顯消化，在胃中的穩(wěn)定性較好。此外，如圖5所示，＜2.5 ku 組分經(jīng)胃腸道消化后，小分子質(zhì)量低聚肽（12～17 min）的色譜峰變化不大，只在13 min 左右出現(xiàn)一個新峰。然而，大分子質(zhì)量多肽（6～10.5 min）的色譜峰降低，甚至10 min左右色譜峰完全消失，相應(yīng)地在11.46 min 左右出現(xiàn)一個新色譜峰，且響應(yīng)值最高。以上結(jié)果表明，＜2.5 ku 組分中大分子質(zhì)量多肽不耐胃腸道消化，可被蛋白酶降解生成更短的肽，而小分子質(zhì)量低聚肽耐胃腸道消化，幾乎不被降解。

圖4 胃消化前、后＜2.5 ku 組分的液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of ＜2.5 ku fraction before and after gastric digestions

圖5 胃腸消化前、后＜2.5 ku 組分的液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of ＜2.5 ku fraction before and after gastrointestinal digestions

2.4 消化前、后DPPH 自由基清除活性的變化

研究發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑用來治療糖尿病具有較少副作用，對糖尿病的治療具有重要意義。DPPH 法是一種快速、易于測定的抗氧化活性評估方法，其表示抗氧化能力的參數(shù)是DPPH 自由基清除率[20]。DPPH 是一種具有單電子的較為穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液呈紫色，在波長517 nm 處有強吸收。在DPPH 溶液中加入抗氧化劑可使其褪色，從而減小吸光度值，因此DPPH 清除率可通過測定OD 值的變化進行分析[21]。將甲魚蛋＜2.5 ku組分及其胃和胃腸消化產(chǎn)物分別做DPPH 分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 胃及胃腸消化前、后＜2.5 ku 組分的DPPH 自由基清除活性Fig.6 DPPH radical-scavenging activities of ＜2.5 ku fraction before and after gastric and gastrointestinal digestions

甲魚蛋＜2.5 ku 組分及其胃和胃腸消化產(chǎn)物均具有顯著的DPPH 自由基清除活性，且隨濃度的增加而線性增加。在相同濃度下，＜2.5 ku 組分經(jīng)胃及胃腸消化后DPPH 自由基清除活性提高了，其中以胃腸消化產(chǎn)物的活性最強。結(jié)合上述，＜2.5 ku 組分具有良好的胃腸道消化特性，其經(jīng)胃腸道消化產(chǎn)生的新肽具有更好的DPPH 自由基清除活性。研究表明，抗氧化肽的自由基清除能力歸因于其含有酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等含羥基氨基酸以及蛋氨酸和半胱氨酸等含巰基氨基酸[22-23]。本研究中，＜2.5 ku 組分經(jīng)胃腸道消化后產(chǎn)生更多的含羥基及巰基氨基酸的抗氧化肽，從而呈現(xiàn)更好的DPPH 自由基清除活性。

2.5 消化前、后ABTS 自由基清除活性的變化

ABTS 是一種水溶性自由基，清除ABTS試驗是體外抗氧化試驗的經(jīng)典之一，該試驗具有一定的代表性，ABTS 陽離子自由基清除能力比DPPH 自由基清除能力更加靈敏[24]，主要根據(jù)待測化合物清除ABTS+所引起的吸光度變化進行分析，將甲魚蛋＜2.5 ku 組分及其胃和胃腸消化產(chǎn)物分別做ABTS 分析，結(jié)果如圖7所示，與DPPH 自由基清除活性相反，＜2.5 ku 組分在消化前具有最高的ABTS 自由基清除活性，經(jīng)胃及胃腸消化后活性均降低。

圖7 胃及胃腸消化前、后＜2.5 ku 組分的ABTS 自由基清除活性Fig.7 ABTS radical-scavenging activities of ＜2.5 ku fraction before and after gastric and gastrointestinal digestions

2.6 消化前、后α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化

α-葡萄糖苷酶是催化碳水化合物最后一步消化的關(guān)鍵酶，其活性與餐后高血糖的發(fā)生密切相關(guān)[25]。α-葡萄糖苷酶水解低聚糖或二糖為可吸收的單糖，促進碳水化合物的吸收。當(dāng)其活性被抑制時，能有效降低碳水化合物的消化達到降低糖的目的。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過延緩膳食中碳水化合物的消化來有效降低餐后高血糖，實現(xiàn)對餐后葡萄糖的控制，是糖尿病防治的一線藥物[26]。因此，可以通過測定α-葡萄糖苷酶抑制活性評價甲魚蛋＜2.5 ku 組分及其胃和胃腸消化產(chǎn)物的降糖作用。如圖8所示，＜2.5 ku組分具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性；胃及胃腸道消化均可顯著提高其抑制活性，其中胃腸道消化后產(chǎn)物在低質(zhì)量濃度（4 mg/mL）下表現(xiàn)很高的抑制活性（80%左右）。

圖8 胃及胃腸消化前、后＜2.5 ku 組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.8 α-Glucosidase inhibitory activities of ＜2.5 ku fraction before and after gastric and gastrointestinal digestions

計算自由基清除及α-葡萄糖苷酶抑制的IC50，其值越小活性越強，結(jié)果見表2。與消化前相比，胃及胃腸道消化可顯著提高＜2.5 ku 組分的DPPH 自由基清除及α-葡萄糖苷酶抑制活性，然而，降低了ABTS 自由基清除活性，其中，胃腸消化產(chǎn)物具有出色的DPPH 自由基清除及α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值較低，低于文獻報道的α-葡萄糖苷酶抑制肽 （RVPSLM，來自雞蛋清蛋白）[27]。此外，植物化學(xué)物（比如黃酮類化合物）被認(rèn)為是安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑[28]。對比文獻報道的來源于天然植物化學(xué)庫中的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如蝦青素、花青素、兒茶素等[29-31]，本研究中＜2.5 ku 組分的胃腸道消化產(chǎn)物呈現(xiàn)極為顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其α-葡萄糖苷酶抑制率達80%左右。

表2 DPPH、ABTS 自由基清除及α-葡萄糖苷酶抑制的IC50 值Table 2 IC50 values of activities for DPPH，ABTS radical-scavenging and α-glucosidase inhibition

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶可有效水解甲魚蛋蛋白，通過超濾法可明顯富集分子質(zhì)量＜2.5 ku 的降糖組分。此方法制備的甲魚蛋＜2.5 ku 組分具有良好的色澤（黃綠色），在胃中穩(wěn)定，然而，不耐胃腸消化，在胃腸道中被消化產(chǎn)生更短的肽。胃腸道消化顯著提高了＜2.5 ku 降糖組分的DPPH 自由基清除及α-葡萄糖苷酶抑制活性。消化產(chǎn)物仍具有較強甚至更好的降血糖潛力。