劉培培,武少蘭,吳敏文,楊成龍,江玉姬,4,陳炳智,4*
(1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002 2 福建省福州市農(nóng)業(yè)局 福州 350000 3 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州 350001 4 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心 福州 350002)
我國(guó)黑木耳產(chǎn)量豐富,占全世界總產(chǎn)量的90%以上[1]。作為一種食用真菌,黑木耳(Auricularia heimuer)因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高而受到消費(fèi)者的青睞,其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、黑色素、黃酮、多酚等多種營(yíng)養(yǎng)成分[2],具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗凝血等多種功能[3-4],在食品和功能產(chǎn)品的研發(fā)方面具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
肥胖(Obesity)是一種慢性的非傳染性疾病,當(dāng)機(jī)體獲得的能量大于消耗的能量時(shí),過(guò)量的脂肪就會(huì)在體內(nèi)堆積,引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂等問(wèn)題,從而對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生不良影響[5]。肝臟為調(diào)節(jié)糖代謝、脂質(zhì)代謝的重要器官,與肥胖有著密切的聯(lián)系,肥胖會(huì)使過(guò)量的肝臟脂質(zhì)在體內(nèi)沉積,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,影響肝臟的正常功能[6-7]。腸道微生物在促進(jìn)人體消化吸收、新陳代謝、抑制病原菌等生命活動(dòng)中有重要作用,已有實(shí)驗(yàn)證明,腸道菌群與人類肥胖有著一定的聯(lián)系[8]。高脂飲食會(huì)降低小鼠體內(nèi)腸道菌群的豐富度和多樣性,改變菌群結(jié)構(gòu)組成,從而引發(fā)宿主代謝的失調(diào),最終誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[9-10]。
某些天然提取物具有抑制肥胖的功效,黑木耳子實(shí)體中富含活性物質(zhì),在預(yù)防和治療肥胖方面有一定的潛力。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠,建立小鼠高脂模型,研究黑木耳醇提物對(duì)高脂肥胖小鼠體質(zhì)量、肝臟功能以及腸道菌群的影響,以期為開發(fā)黑木耳功能食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
黑木耳子實(shí)體 (Auricularia heimuer fruiting body)由北大荒營(yíng)銷股份有限公司提供,新鮮黑木耳經(jīng)清洗、曬干,未經(jīng)化學(xué)處理。
奧利司他膠囊,魯南制藥集團(tuán)。
無(wú)水乙醇(分析純),西隴科學(xué)股份有限公司;福爾馬林,北京蘭杰柯科技有限公司;血清葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)試劑盒,南京建成生物工程研究所。
BSA224S 電子分析天平,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;LGJ-12 真空冷凍干燥機(jī),北京松源有限公司;BA210T 顯微鏡,Motic 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;M199 切片刀,德國(guó)萊卡公司;YD-315 切片,機(jī)浙江金華益迪試驗(yàn)器材。
5 周齡雄性ICR 小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,體質(zhì)量(15±2)g,動(dòng)物合格證為SCXK(滬)2017-0005。
1.3.1 黑木耳醇提物以及飼料的制備 黑木耳醇提物參照黃琳翔等[11]研究的工藝流程進(jìn)行提取。動(dòng)物飼料(基礎(chǔ)飼料和高脂飼料),閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限責(zé)任公司。
1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 72 只5 周齡健康雄性ICR小鼠同室分籠飼養(yǎng),第1 周使用基礎(chǔ)飼料飼喂,使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。1 周后,小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CK)、高脂組(HFD)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(PD)、AHA 低劑量組 (LC)、AHA 中劑量組(MC)、AHA高劑量組(HC),共6 組,每組12 只小鼠。
CK 組用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng),HFD、PD、LC、MC、HC組用高脂飼料飼養(yǎng),待高脂組小鼠的體質(zhì)量顯著高于空白組小鼠體質(zhì)量時(shí),即造模成功[12]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”進(jìn)行。
待小鼠體質(zhì)量升至(20±2)g 時(shí),灌胃,固定每天的灌胃時(shí)間,灌胃劑量為0.1 mL/10 g,CK 組和HFD 組每日灌蒸餾水;陽(yáng)性藥物對(duì)照組灌胃奧利司他,濃度為50 mg/kg bw;AHA 低劑量組灌胃濃度為150 mg/kg bw;AHA 中劑量組灌胃濃度300 mg/kg bw;AHA 高劑量組灌胃濃度為600 mg/kg bw。
1.3.3 小鼠樣品的收集 第9 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠不斷水,但禁食12 h,眼球采血后進(jìn)行脫頸處死,收集血液后進(jìn)行解剖,取下小鼠肝臟、脾、腎臟組織、皮下脂肪、附睪脂肪,用0.9%生理鹽水清洗干凈后稱重;用于組織切片分析的肝臟儲(chǔ)存在10%福爾馬林中;小鼠盲腸樣本收集后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.4 小鼠生理生化指標(biāo)的檢測(cè)
1.3.4.1 小鼠體質(zhì)量和Lee's 指數(shù) 每天對(duì)小鼠定時(shí)稱重,每周進(jìn)行體長(zhǎng)測(cè)量(鼻尖至肛門距離),Lee's 指數(shù)按公式(1)計(jì)算[13]。
1.3.4.2 小鼠臟器指數(shù) 肝臟、脾、腎臟、附睪脂肪、皮下脂肪稱重后,按公式(2)計(jì)算臟器指數(shù)[14]。
1.3.4.3 小鼠血清葡萄糖含量的測(cè)定 將1.3.3節(jié)采集的小鼠血液室溫靜置0.5 h 后,4 ℃,5000 r/min 離心10 min,吸取上清液,根據(jù)南京建成試劑盒的操作步驟,測(cè)定小鼠血清中GLU 的含量。
1.3.4.4 小鼠肝臟指標(biāo)的測(cè)定 用生理鹽水將部分肝臟清洗后,按9 mL/g 加入無(wú)水乙醇,在冰浴下進(jìn)行充分勻漿后離心10 min (4 ℃,5 000 r/min),取上清液為待測(cè)樣品,采用試劑盒測(cè)定小鼠肝臟中TC、TG、HDL-C、LDL-C 的濃度。
1.3.4.5 小鼠肝臟切片分析 將處理好的小鼠肝臟樣品委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行制片、染色和顯微觀察。
1.3.5 小鼠腸道菌群分析測(cè)定 將1.3.3 節(jié)采集的盲腸待測(cè)樣品交派邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行菌群鑒定分析。
所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和比較用SPSS 16.0 軟件,以P<0.05 為顯著差異,以P<0.01 為極顯著差異。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,小鼠生長(zhǎng)和精神狀況良好,無(wú)異常死亡。圖1顯示了不同組別小鼠的體質(zhì)量變化情況。從圖1中可以得出,經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)期后,各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。灌胃1 周后,與CK 組相比,HFD 組小鼠的體質(zhì)量增加了3.16 g,二者之間有顯著差異(P<0.05),說(shuō)明長(zhǎng)期高脂飲食使得小鼠體質(zhì)量增加和脂肪堆積[15],從而造模成功;灌胃3 周后,HFD 組、PD 組、LC組、MC 組、HC 組與CK 組體質(zhì)量分別相差5.11,2.44,2.40,3.00,0.29 g,HFD 組與CK、HC 組之間呈極顯著差異(P<0.01),與MC 組、PD 組之間有顯著差異(P<0.05);實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與CK 組相比,HFD 組、PD 組、LC 組、MC 組、HC 組的體質(zhì)量分別增加了9.43,3.17,3.78,4.15,1.57 g,HFD 組體質(zhì)量極顯著高于CK 組(P<0.01),與HFD 組相比,3 個(gè)劑量處理組和PD 組均有效抑制了小鼠體質(zhì)量的增加(P<0.01),表明AHA 提取物和藥物干預(yù)均有預(yù)防小鼠營(yíng)養(yǎng)性肥胖的功效。
圖1 不同組小鼠體質(zhì)量變化情況Fig.1 Changes of body weight in different groups of mice
圖2為不同組小鼠Lee's 指數(shù)變化情況。從圖2可知,Lee's 指數(shù)的變化趨勢(shì)呈逐漸增加,這與體質(zhì)量變化趨勢(shì)一致。灌胃初始各組小鼠Lee's 沒(méi)有明顯的差異(P>0.05);隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng),CK組與HFD 組差異開始達(dá)到顯著水平(P<0.05),第2 周,二者差異極顯著(P<0.01);灌胃6 周后,AHA處理后的小鼠Lee's 指數(shù)極顯著低于HFD 組(P<0.01),說(shuō)明AHA 有抑制小鼠體長(zhǎng)增加的效果。上述結(jié)果表明AHA 干預(yù)可降低小鼠體質(zhì)量的增量,且呈劑量依賴性,高劑量組的效果最好。
圖2 小鼠LEE'S 指數(shù)變化Fig.2 Changes of Lee's index in mice
圖3顯示不同組小鼠的臟器指數(shù)變化。由圖3a 可知,HFD 組小鼠附睪脂肪指數(shù)極顯著高于CK 組(P<0.01),表明高脂飲食增加了小鼠附睪脂肪指數(shù);PD 組和AHA 處理組小鼠附睪脂肪指數(shù)顯著低于HFD 組(P<0.05),且AHA 降低效果呈現(xiàn)劑量依賴性。由圖3b 可知,HFD 組的皮下脂肪指數(shù)顯著高于CK 組(P<0.01),而PD 組、LC 組、MC 組和HC 組均能降低皮下脂肪指數(shù),其中MC組、PC 組與HFD 組有顯著性差異(P<0.05)。小鼠肝臟指數(shù)可以反映肝臟的損傷程度[16]。由圖3c 可知,HFD 組的肝臟指數(shù)明顯高于CK 組(P<0.01),表明高脂飲食會(huì)導(dǎo)致脂肪積累,加重肝臟負(fù)擔(dān)和病變;而PD 組、AHA 處理的肝臟指數(shù)顯著低于HFD 組(P<0.01),表明陽(yáng)性藥物處理和AHA 處理均能夠降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的肝臟指數(shù),改善肝損傷,保護(hù)肝臟組織。由圖3d 和圖3e 可知,HFD小鼠腎臟和脾臟指數(shù)增加不顯著 (P>0.05),PD組、AHA 處理組也無(wú)顯著變化,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。
圖3 不同組的小鼠臟器指數(shù)Fig.3 Organ index of mice in different groups
以上數(shù)據(jù)表明,與CK 組相比,HFD 組對(duì)肝臟產(chǎn)生明顯的損害作用,而AHA 處理能有效降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖,改善肝臟組織,降低肝臟的損傷程度,對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用。
肝臟是維持全身葡萄糖(GLU)穩(wěn)定的重要器官,肥胖癥患者往往伴隨著GLU 含量的升高,引起血脂異常,因此測(cè)定血清中葡萄糖含量對(duì)判斷機(jī)體健康具有十分重要的意義[18]。由圖4可知,HFD 組血清GLU 含量極顯著高于其余各組 (P<0.01),表明高脂飲食會(huì)顯著提高小鼠的血糖水平;而AHA 處理組均能夠顯著降低血清GLU 濃度,且降低效果與AHA 有劑量依賴性,其中HC組降血糖效果與PD 組接近,說(shuō)明AHA 具有降血糖功效。
圖4 不同組小鼠血清中的葡萄糖含量Fig.4 Contents of GLU in serum of different groups of mice
由圖5a 可知,與CK 組相比,HFD 顯著增加了小鼠肝臟中TC 含量(P<0.05),表明高脂飲食會(huì)增加小鼠肝臟中TC 含量,與HFD 組相比,HC 高劑量組能夠顯著降低肝臟中TC 的含量(P<0.01)。由圖5b、圖5c 可知,HFD 組小鼠肝臟中的TG 含量、LDL-C 含量明顯高于CK 組(P<0.01),而AHA組小鼠肝臟內(nèi)的TG 含量、LDL-C 含量均比HFD組低,說(shuō)明AHA 能夠顯著降低肥胖小鼠肝臟內(nèi)的TG 含量、LDL-C 含量 (P<0.01)。由圖5d 可知,HFD 組中的HDL-C 含量顯著低于CK 組 (P<0.01),表明高脂會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)HDL-C 含量的降低,與HFD 組相比,LC 組、MC 組無(wú)差異(P>0.05),而HC 組能夠顯著提高肝臟中HDL-C 含量(P<0.05)。
圖5 不同組小鼠肝臟4 項(xiàng)的含量Fig.5 Contents of four items in liver of different groups of mice
以上數(shù)據(jù)表明,高脂飲食會(huì)增加小鼠肝臟中TC、TG 和LDL-C 的含量,而AHA 則能夠降低這些物質(zhì)的含量,且HC 組能夠提高肝臟中HDL-C的含量,對(duì)防止脂肪代謝紊亂有一定功效。
HE 染色結(jié)果如圖6所示,CK 組小鼠肝臟細(xì)胞大小基本一致且結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核清晰、可見(jiàn)并位于細(xì)胞中央;HFD 組小鼠肝臟細(xì)胞核模糊,細(xì)胞明顯增大,肝臟組織中積累大量脂滴,且有脂肪空泡,這表明高脂飲食會(huì)破壞小鼠肝臟脂質(zhì)代謝,從而造成大量脂肪在肝臟中積累。在AHA 組中,可以看到隨著劑量的增大,小鼠細(xì)胞核逐漸清晰,脂肪細(xì)胞變小,脂滴減小,脂肪空泡也明顯減少,其中AHA 高劑量組的脂肪細(xì)胞與CK 組相近,表明AHA 處理組能夠抑制小鼠脂肪肝形成。綜上,通過(guò)動(dòng)物肝臟細(xì)胞病理切片可知,AHA 處理組的脂肪空泡明顯減少,細(xì)胞排列較整齊,在抑制脂肪肝和肝臟脂肪積累方面有明顯效果,能有效改善肝臟組織,減輕病變程度,對(duì)高脂飲食小鼠的肝臟具有明顯的保護(hù)作用。
圖6 黑木耳醇提物對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響(HE 染色400×)Fig.6 Effect of AHA on histomorphological of the live of mice (HE staining 400×)
2.6.1 OTU Venn 圖分析 對(duì)樣本的Effective Tags 在97%的一致上進(jìn)行OTUs 聚類和物種注釋,結(jié)果見(jiàn)圖7,CK 組與HFD 組共有的OTU 數(shù)量為1 558,與HC 組共有的OTU 為153;HFD 組與HC 組共有的OTU 數(shù)量為1 850,說(shuō)明HFD 組和HC 組的OTU 相似性和重疊性更高,高脂飲食在一定程度上改變了小鼠腸道菌群的組成。
圖7 3 組樣本的韋恩圖Fig.7 Venn diagram in three samples
2.6.2 Alpha 多樣性分析 小鼠腸道菌群變化情況可用Shannon、Simpson、Chao1 指數(shù)分析。從表1可以看出,CK 組、HFD 組、HC 組的Coverage 指數(shù)分別是0.996,0.995,0.992,說(shuō)明該測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠[19]。HFD 組的Simpson 和Shannon 指數(shù)較CK組略有降低,而Chao1 指數(shù)有所增加,表明高脂飲食在一定程度上降低了小鼠腸道菌群多樣性,與魏建敏等[20]研究結(jié)果相似;經(jīng)AHA 處理后,與CK組、HFD 組相比,HC 組腸道微生物多樣性最高,說(shuō)明AHA 干預(yù)可調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道微生物的多樣性。
表1 各組小鼠樣本中α 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of each group
2.6.3 菌群結(jié)構(gòu)分析 由圖8可知,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria) 是3 組小鼠樣本在門水平上的主要優(yōu)勢(shì)菌群。厚壁菌門和擬桿菌門是人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)有益菌,與CK 組相比,高脂飲食降低了小鼠腸道菌群厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度,經(jīng)過(guò)AHA 干預(yù),厚壁菌門和擬桿菌門有所增加,而差異不顯著 (P>0.05),推測(cè)是AHA 添加量的原因,后續(xù)將做進(jìn)一步研究;與CK 組相比,HFD 顯著增加了小鼠腸道菌群變形菌門的相對(duì)豐度(P<0.05),變形菌門多數(shù)屬于致病菌,表明高脂飲食會(huì)損害正常小鼠腸道菌群,而經(jīng)HC 處理后該菌群漲幅不大,與模型對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明AHA 對(duì)高脂飲食小鼠的腸道菌群有調(diào)節(jié)作用,并能抑制部分有害菌的生長(zhǎng)。
圖8 樣本群落結(jié)構(gòu)在門水平分布圖Fig.8 Community structure distribution of sample in phylum level
根據(jù)類群注釋結(jié)果,在屬層面分析了各類群的豐度。屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖如圖9所示。3 組小鼠樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有螺桿菌屬(Helicobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、毛螺旋桿菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、另枝菌屬(Alistipes)。與CK 組相比,HFD 組擬桿菌屬的相對(duì)豐度極顯著增加(P<0.01),而經(jīng)AHA 干預(yù),小鼠腸道菌群中擬桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低(P <0.01);Lachnospiraceae_NK4A136_group 屬是有益菌屬,與CK 組相比,高脂飲食降低了小鼠Lachnospiraceae_NK4A136_group 的相對(duì)豐度,而經(jīng)過(guò)AHA 處理,Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對(duì)豐度有所增加,以上結(jié)果說(shuō)明AHA 對(duì)高脂飲食引起的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成紊亂具有積極的調(diào)節(jié)作用。
圖9 樣本群落結(jié)構(gòu)在屬水平分布圖Fig.9 Community structure distribution of sample in genus level
黑木耳具有多種活性物質(zhì),其醇提物的主要活性成分是黃酮和多酚類物質(zhì)[21-22]。本研究通過(guò)高脂膳食建立高脂小鼠模型,研究了黑木耳醇提物對(duì)小鼠肥胖的抑制作用,肝臟功能以及腸道菌群的影響,主要結(jié)論如下:
高脂肥胖小鼠經(jīng)AHA 干預(yù)后,小鼠體質(zhì)量和體長(zhǎng)的增加得到抑制,說(shuō)明黑木耳醇提物具有抑制肥胖的功效,這與郭彤彤等[23]對(duì)烏龍茶中多酚的研究結(jié)果相似。對(duì)小鼠肝臟指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn):AHA 處理顯著降低了小鼠附睪脂肪指數(shù)、皮下脂肪指數(shù)和肝臟指數(shù),肝臟中的TG、TC 和LDL-C含量也顯著降低,且高劑量處理能顯著增加肝臟中HDL-C 的濃度。經(jīng)AHA 處理,高脂肥胖小鼠血清中GLU 含量顯著降低,說(shuō)明黑木耳醇提物具有較顯著的降血糖功效。劉天一等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)黑木耳醇提物在體外具有抗氧化和抑制α-淀粉酶活性的效果,這與前期體外試驗(yàn)結(jié)果一致[11]。王方杰等[25]發(fā)現(xiàn)胡柚黃酮對(duì)減輕高脂飲食引起的肝臟病變等問(wèn)題有一定改善作用,本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝臟細(xì)胞染色觀察發(fā)現(xiàn):AHA 處理能夠減少脂肪積累,抑制脂肪肝的形成,具有改善肝臟組織,減輕肝臟病變程度的作用,與上述王方杰等[25]的研究結(jié)果一致,由此推測(cè)AHA 中的黃酮物質(zhì)對(duì)于肝臟損傷具有緩解作用,可進(jìn)一步深入研究。
高脂膳食會(huì)影響人體腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能,而腸道菌群對(duì)人體的脂代謝平衡具有重要作用,與肥胖的發(fā)生具有密切關(guān)系[26]。本實(shí)驗(yàn)中,高脂飲食改變了小鼠腸道菌群的豐度及結(jié)構(gòu)組成,這與彭買姣等[27]研究高脂飲食對(duì)腸道微生物影響的結(jié)果是一致的,多酚和黃酮能夠改善腸道的生態(tài)平衡[28-29],而AHA 干預(yù)對(duì)高脂肥胖小鼠腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)具有積極的調(diào)節(jié)作用,并能抑制部分有害菌的生長(zhǎng),推測(cè)可能是黃酮和多酚共同作用的結(jié)果。由于機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,本文只分析了門和屬水平上相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌種,還有大部分腸道菌群有待分析,需要進(jìn)一步深入研究。
綜上所述,黑木耳醇提物在抑制高脂肥胖,改善肝損傷,維持肝臟功能以及調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成方面,具有積極作用,后續(xù)將對(duì)黑木耳醇提物改善肝損傷的機(jī)制進(jìn)行深入研究,為黑木耳深加工提供理論依據(jù)。