鄧 珂，楊良緣，胡 鈺，許光治，王 艷，張有做，倪勤學(xué)

（浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院 杭州 311300）

豆芋（Apios americana Medik）是一種起源于北美洲東部地區(qū)的可食用性豆科土圞兒屬植物[1]，也是幾千年前印地安人的主要食物，又稱之為“印第安馬鈴薯”。豆芋塊莖富含蛋白質(zhì)、亞油酸、礦物質(zhì)等多組營養(yǎng)素[2]，同時富含異黃酮、多酚、皂苷、生物堿、抗性淀粉等生理活性物質(zhì)[3-8]，是一種營養(yǎng)豐富的健康食品。國外研究表明，豆芋塊莖具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒的功效，特別對代謝紊亂造成的高血糖、高血壓、高血脂、肥胖等病癥具有明顯的防治作用[2]。

食物經(jīng)加工后，物理特性、營養(yǎng)特性均會發(fā)生改變[9]。如：豆芋塊莖中總酚、總黃酮、總糖、異黃酮和生物堿等活性成分會隨著加工溫度等條件的變化而變化，然而，至今國內(nèi)外未有關(guān)于加工方式對豆芋塊莖中有效組分含量及抗氧化、α-葡萄糖苷酶的影響，且有效組分進(jìn)入消化系統(tǒng)后，其穩(wěn)定性和抗氧化活性易受環(huán)境中的pH 值、溫度、酶和其它相關(guān)因素的影響，導(dǎo)致有效組分的吸收釋放各不相同[10]。因體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，難以控制，故引入體外模擬消化這一方法，體外模擬人體消化道的pH值、溫度、酶等易控制的條件，使其盡可能接近體內(nèi)環(huán)境，該方法快速、安全、簡單且重現(xiàn)性好，已廣泛應(yīng)用于研究各種活性物質(zhì)在消化過程中的變化[11]。Huang 等[12]通過模擬胃腸消化，檢測7 種海藻酚類含量和抗氧化的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻中游離酚類含量在腸消化中顯著增加，因酚類物質(zhì)增加而抗氧化明顯增強(qiáng)；Liang 等[13]發(fā)現(xiàn)模擬消化后桑樹提取物清除自由基的能力顯著增加，具有良好的抗氧化活性。

因通常情況下，在食用馬鈴薯、葛根、山藥等塊根時均要做去表皮處理，故選用去皮豆芋作對照組，采用帶皮、發(fā)酵、膨化、炒制等加工方法處理豆芋塊莖，借助體外模擬消化法評估豆芋塊莖中總酚、總黃酮、總糖、異黃酮、生物堿含量及抗氧化（DPPH、ABTS+、FRAP）、α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化，為最大限度地保留豆芋的營養(yǎng)成分，將其作為新型功能性食品原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆芋7月采自浙江農(nóng)林大學(xué)平山基地。

福林酚試劑、α-淀粉酶（α-Amylase）、胃蛋白酶（Pepsin）、胰酶（Pancreatin）、α-葡萄糖苷酶，Sigma 公司；染料木苷、鹽酸小檗堿、蘆丁、沒食子酸、葡萄糖，上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、硝酸鋁，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-以及苯并噻唑林-6-磺酸（ABTS），阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上?；菡\生物科技有限公司；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500 紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，沙鷹科學(xué)儀器（上海）有限公司；BSA224S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器 （北京） 有限公司；PHS-3F 實驗室pH 計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；搖床，華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司；YB-1000A高速多功能粉碎機(jī)，永康速鋒工貿(mào)有限公司；SLG65-Ш 同向旋轉(zhuǎn)雙螺桿擠壓機(jī)，濟(jì)南賽百諾科技開發(fā)有限公司；Velocity18R 臺式冷凍離心機(jī)，Dynamica 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 處理方法

1） 對照組（去皮） 新鮮的豆芋塊莖洗凈，除去表皮后切成約20 mm 厚的薄片，于60 ℃烘箱干燥，全部干燥后冷卻，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。

2） 帶皮組 新鮮的豆芋塊莖洗凈、晾干，切成約20 mm 厚的薄片，60 ℃烘箱干燥，全部干燥后冷卻，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩，備用。

3） 炒制組 將“去皮豆芋”于95 ℃炒鍋中不斷翻炒，至鍋內(nèi)產(chǎn)生焙烤的豆芋香味，原料顏色變化至黃色，再炒制5 min[14]，冷卻后密封，備用。

4） 擠壓膨化組 將“去皮豆芋”加入螺旋雙桿擠出機(jī)中，通過噴淋和攪拌的方式調(diào)節(jié)水分，使原料含水率約20%，設(shè)置擠壓機(jī)前、中、后段溫度分別為50，125，135 ℃，螺桿旋轉(zhuǎn)速率為28 Hz，結(jié)束后于60 ℃烘箱干燥，冷卻后密封，備用[15]。

5） 發(fā)酵組 將“去皮豆芋”與酵母水混合，攪拌至黏稠狀，揉成直徑約5 cm 的實心團(tuán)，于37℃、濕度為70%的恒溫發(fā)酵箱中發(fā)酵2 h，60 ℃烘箱干燥，多次粉碎后過80 目篩，備用。

1.3.2 體外模擬消化處理 體外模擬消化液的配制：參考龔凌霄[16]的方法，略有改動，具體如下：

1） 人工唾液 分別稱取Na2HPO42.38 g、KH2PO40.19 g、NaCl 8.00 g，加水溶解，調(diào)pH 值至6.75，加入α-淀粉酶（1.30 g）。

2） 人工胃液 稱取NaCl 2.0 g、胃蛋白酶3.2 g，溶于含7.0 mL HCl 溶液的1 000 mL 水溶液中（pH≈1.2）。

3） 人工腸液 稱取KH2PO46.8 g 溶于250 mL 水中，加入77 mL 0.1 mol/L NaOH 和500 mL水，混勻，加入10.0 g 胰酶，調(diào)pH 值至6.8±0.1，加水稀釋至1 000 mL。

體外模擬消化過程：分別取5.0 g 不同加工處理的豆芋樣品，于37 ℃水浴孵育，模擬消化從唾液開始，加入2.5 mL 人工唾液，調(diào)pH 值至7.0，37℃恒溫水浴振蕩10 min；加入50 mL 人工胃液，調(diào)pH 值至2.5，37 ℃恒溫水浴振蕩2 h，模擬胃消化階段；加入50 mL 人工腸液，調(diào)pH 值至7.5，37 ℃恒溫水浴振蕩2 h，模擬小腸消化階段。冰浴中放置10 min 終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清液供分析用。

對照組：分別取5.0 g 不同加工處理的豆芋樣品，步驟同上，添加消化液的地方均改為加鹽水，將得到的反應(yīng)液于10 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液供分析用。

1.4 豆芋主要組分測定方法

1） 總酚含量的測定 參考Singleton 等[17]略有改動。稱取25.0 mg 沒食子酸，加水定容至100 mL，分別取0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.20 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL，加入0.5 mL 福林酚試劑和2 mL 20%Na2CO3溶液，40 ℃水浴加熱30 min，冷卻后稀釋至25 mL。以不含沒食子酸為空白對照，于波長760 nm 處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將1.3.2 節(jié)所得上清液重復(fù)上述操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算總酚含量。

2） 生物堿含量的測定 參考Fazel 等[18]的方法并略有改動。稱取2.0 mg 鹽酸小檗堿，乙醇定容至100 mL，吸取1.0，2.0，3.0，4.0，6.0 mL，乙醇定容至10 mL，以乙醇試劑為空白，于波長350 nm下測吸光度值，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將1.3.2 節(jié)體外模擬消化和對照組所得上清液重復(fù)上述操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算生物堿含量。

3） 總黃酮含量的測定 采用硝酸-亞硝酸鈉比色法，參考鄭媛媛等[19]的方法并稍作修改。稱取15.0 mg 蘆丁，用水定容100 mL，分別取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，定容至5 mL，加5%亞硝酸鈉溶液（0.3 mL），混勻靜置5 min，加入10%硝酸鋁溶液（0.3 mL），混勻靜置6 min，加2 mL 1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液，用水定容10 mL，靜置10 min。以不含蘆丁的溶液為空白對照，于波長510 nm 處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將2.2 節(jié)所得上清液重復(fù)上述操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算總黃酮含量。

4） 異黃酮含量的測定 采用紫外（UV）比色法測定異黃酮含量，參考Shinde 等[20]稍加改動。以染料木苷為對照品，稱取6.0 mg 染料木苷，用乙醇溶解并定容25 mL。分別移取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，稀釋至10 mL，于波長268 nm 處測定吸光度，以染料木苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將2.2 節(jié)所得上清液重復(fù)上述操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算總異黃酮含量。

5） 總糖含量的測定 參考Tsukakoshi 等[21]的苯酚硫酸法并略有改動。取8.0 mg 葡萄糖溶于100 mL 水中，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，1.0，1.4，1.6，1.8 mL，加水補(bǔ)至2.0 mL，反應(yīng)20 min，于波長490 nm 處測吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將2.2 節(jié)所得上清液重復(fù)上述操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算總糖含量。

1.5 豆芋抗氧化的測定方法

1.5.1 DPPH 自由基清除率的測定 參考Hou 等[22]的方法并略加改動。

試驗組：將2 mL 樣品與等體積的0.1 mmol/L DPPH 混合，避光反應(yīng)30 min。對照組：2 mL 樣品與等體積乙醇混合避光反應(yīng)30 min?？瞻讓φ战M：2 mL 乙醇與等體積0.1 mmol/L DPPH 混合，避光反應(yīng)30 min。以L-抗壞血酸為陽性對照，于波長517 nm 處測定吸光度值。按公式（1）計算DPPH 自由基清除率。

式中，A0——空白對照組吸光度；Ai——試驗組吸光度；Aj——對照組吸光度。

1.5.2 ABTS+自由基清除率的測定 參考Hou等[22]的方法并略有改動。試驗組：將0.1 mL 豆芋樣品與3.9 mL ABTS+工作液混合，避光靜置反應(yīng)7 min。對照組：將0.1 mL 樣品與3.9 mL 乙醇混合，避光靜置反應(yīng)7 min?？瞻讓φ战M：將0.1 mL 乙醇與3.9 mL ABTS+工作液混合，避光靜置7 min。以L-抗壞血酸為陽性對照，于波長734 nm 處測定吸光度值，按照公式（2）計算ABTS+清除率：

式中，A0——空白對照組吸光度；Ai——試驗組吸光度；Aj——對照組吸光度。

1.5.3 鐵離子還原力測定（FRAP 法） 參考趙建等[23]的方法并略有改動。FRAP 工作液的配制：由300 mmol/L 乙酸鈉溶液、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L 三氯化鐵溶液按體積比10∶1∶1 配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取0.07，0.14，0.28，0.42，0.56，0.70，0.84 mmol/L 硫酸亞鐵 （各0.1 mL），加入0.3 mL 水和3.0 mL FRAP 工作液，充分混勻，室溫避光反應(yīng)50 min，以水作空白對照，于波長593 nm 處測定吸光度值，以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品鐵離子還原力測定：取0.4 mL 供試品溶液，加入3.0 mL FRAP 工作液，步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，將得到的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求等體積情況下對鐵離子的還原能力。

1.5.4 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 參考王靜等[24]的方法并加以改進(jìn)。試驗組：將100 μL 樣品溶液與等體積0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶混合，37℃反應(yīng)10 min，加入100 μL 對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖（2.5 mmol/L PNPG）溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，加入5 mL 0.1 mmol/L NaCO2溶液終止反應(yīng)，于波長405 nm 處測定吸光度值?？瞻捉M：用去離子水代替樣品，步驟同試驗組。對照組：緩沖液代替酶，步驟同試驗組。按照公式（3）計算抑制率：

式中，A樣品——試驗組吸光度；A對照——對照組吸光度；A空白——空白對照組吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 加工方式對豆芋有效組分含量的影響

加工方式對豆芋總酚、總黃酮、總糖、異黃酮、生物堿含量的影響如表1所示。模擬消化后，豆芋中總酚、總黃酮、總糖、異黃酮和生物堿含量均顯著高于對照組，且生物堿增幅最大，增加83.22%～148.83%，說明模擬消化可促進(jìn)總酚、總黃酮、總糖、異黃酮和生物堿的釋放，并且生物堿的促進(jìn)釋放作用最大。因模擬消化后總酚、總黃酮、總糖、異黃酮、生物堿含量顯著增加，且更接近人體利用度，故采用體外模擬消化法評估加工方式對有效組分含量的影響。

表1 加工方式對豆芋有效組分含量的影響Table 1 Effects of processing method on contents of effective components of Apios americana Medik

模擬消化后，總酚含量由大到小的加工方式是發(fā)酵＞帶皮＞擠壓膨化＞炒制＞對照組，分別增加73.46%，34.13%，6.32%，3.85%，其中發(fā)酵和帶皮處理是保留總酚最好的加工方式；擠壓膨化、帶皮處理使總黃酮含量分別增加19.68%，11.82%。擠壓膨化處理時，高溫、高壓作用使結(jié)合態(tài)黃酮、酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)被釋放出來，從而使總黃酮、總酚含量升高[25]。總糖含量由大到小的加工方式是炒制＞擠壓膨化＞發(fā)酵＞帶皮＞加工對照組，分別增加31.19%，13.28%，10.62%，2.37%。炒制處理時高溫等環(huán)境條件使部分淀粉轉(zhuǎn)化為糖類，從而使總糖含量增加。發(fā)酵處理的樣品中異黃酮含量增加42.02%，可見發(fā)酵處理能很好地促進(jìn)異黃酮物質(zhì)的溶出，帶皮處理也使異黃酮含量增加9.52%。生物堿含量由大到小的加工方式是發(fā)酵＞擠壓膨化＞帶皮＞炒制＞對照組，其中發(fā)酵、擠壓膨化處理生物堿含量增幅最大，分別增加56.61%和38.91%。

2.2 加工方式對豆芋抗氧化活性的影響

加工方式對豆芋抗氧化能力的影響如圖1所示。模擬消化后，去皮、帶皮、擠壓膨化、發(fā)酵、炒制處理清除DPPH、ABTS+自由基和FRAP 的能力均顯著高于對照組。最終采用體外模擬消化法評估加工方式對豆芋抗氧化的影響。

從圖1b 可知，清除ABTS+自由基的能力在模擬消化后顯著高于對照組，其中，發(fā)酵處理清除效果最顯著，較對照組增加41.96%，這可能是因為發(fā)酵處理后總酚、總黃酮、異黃酮、生物堿等活性物質(zhì)含量增加，起抗氧化作用的物質(zhì)更多，所以清除ABTS+自由基的能力強(qiáng)，帶皮、擠壓膨化處理分別使清除ABTS+自由基能力增加26.76%和21.02%。

圖1 不同加工方式對抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of different processing methods on oxidation resistance

清除DPPH 自由基能力由強(qiáng)到弱的加工方式是帶皮＞發(fā)酵＞擠壓膨化＞炒制＞對照組，較對照組分別增加19.77%，13.94%，8.57%，6.81%；鐵離子還原力的增加趨勢基本與DPPH 相符，由強(qiáng)到弱依次是帶皮＞發(fā)酵＞擠壓膨化＞對照組，分別增加35.99%，19.70%，3.24%。其中，DPPH 和FRAP 代表的抗氧化能力，均是帶皮處理最顯著，說明豆芋塊莖的表皮中也含有抗氧化活性物質(zhì)。

2.3 加工方式對α-葡萄糖苷酶抑制性影響

加工方式對α-葡萄糖苷酶活性抑制的影響如表2所示。由于對照組抑制α-葡萄糖苷酶活性所需濃度太高，在有限濃度內(nèi)未檢出。模擬消化后，發(fā)酵處理對α-葡萄糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度為621.31 μg/mL，抑制能力增加33.6%，這可能因為是發(fā)酵處理使活性物質(zhì)溶出更多，對α-葡萄糖苷酶抑制率大。

表2 加工方式對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Table 2 Effects of processing methods on α-glucosidase on inhibitory activity

2.4 相關(guān)性分析

總酚、總黃酮、總糖、異黃酮、生物堿含量與抗氧化指標(biāo)（清除DPPH、ABTS+自由基、FRAP）之間的相關(guān)性分析見表3。總酚含量與DPPH、ABTS+自由基、FRAP 之間均呈正相關(guān)。DPPH、ABTS+自由基清除率與有效組分之間的相關(guān)性趨勢一致，相關(guān)性由大到小依次是總酚＞生物堿＞異黃酮＞總糖＞總黃酮，其中總酚含量與ABTS+自由基清除率之間的相關(guān)性為0.895，這與發(fā)酵處理組總酚含量最高、清除ABTS+自由基能力最強(qiáng)的事實相符合。FRAP 與異黃酮含量相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為0.722，說明異黃酮含量對鐵離子還原能力起主要作用。

表3 有效組分含量與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of effective component content and antioxidant index

3 討論

采用體外模擬胃、腸消化評估加工方式對豆芋塊莖中總酚、總黃酮、異黃酮、總糖、生物堿含量及抗氧化（DPPH、ABTS+清除及FRAP 體系）、α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，結(jié)果表明，模擬消化后有效組分含量、抗氧化能力、對α-葡萄糖苷酶活性抑制率均顯著增加。其中，F(xiàn)RAP 與DPPH 代表的抗氧化能力趨勢接近，均是帶皮處理抗氧化能力最強(qiáng)，較對照組分別增加19.77%，35.99%，抗氧化能力由強(qiáng)到弱的加工方式是帶皮＞發(fā)酵＞擠壓膨化＞對照組；發(fā)酵處理組清除ABTS+自由基、α-葡萄糖苷酶抑制效果最顯著，較對照組分別增加41.96%，33.6%。

發(fā)酵處理是保留豆芋總酚、異黃酮、生物堿的最適加工方法，較對照組分別增加73.46%，42.02%，56.61%。擠壓膨化處理是保留總黃酮的最適加工方法，含量增加19.68%。炒制處理是保留總糖的最適加工方法，含量增加31.19%。

有效組分含量與DPPH、ABTS+、FRAP 之間呈正相關(guān)，其中總酚含量與DPPH、ABTS+自由基清除率之間的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)分別為0.674，0.895，F(xiàn)RAP 與異黃酮含量相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為0.722，說明清除DPPH、ABTS+自由基起主要作用的物質(zhì)是總酚，鐵離子還原力的決定物質(zhì)是異黃酮。