孫晉躍，張 衡，張嬌嬌，孫芝蘭，劉 芳*，都立輝

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 南京 210095 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京 210014 3 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 南京 210023）

食源性致病菌不僅導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，而且會(huì)引發(fā)一些食源性疾病[1]。食品中常見的食源性致病菌主要包括腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌[2]。沙門氏菌（Salmonella）是一種革蘭氏陰性菌，主要寄生在人類和動(dòng)物的腸道中，并廣泛存在于肉類及蛋類產(chǎn)品中，引發(fā)的食源性疾病癥狀有發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉等[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國由細(xì)菌引起的食物中毒中，腸炎沙門氏菌所引起的食物中毒占很大比例[5]。此外，生物膜是細(xì)菌污染食品的另一種方式。生物膜是一種具有三維結(jié)構(gòu)的微生物群落，在生物膜的胞外存在各種各樣的生物大分子會(huì)對微生物起到保護(hù)作用，因此生物膜的存在會(huì)增加滅菌的難度[6-7]。許多研究報(bào)道了腸炎沙門氏菌具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，可以在食品的表面、不銹鋼、聚氯乙烯（聚氯乙烯）和玻璃等形成生物膜[8-11]。鑒于沙門氏菌的危害，開發(fā)一種既安全又有效的方法來抑制腸炎沙門氏菌游離菌體和生物膜的生長顯得尤其重要。

超聲為一種新型的非熱殺菌方式，主要通過空化作用來破壞微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)并使之產(chǎn)生亞致死損傷[12-14]。然而，當(dāng)超聲單獨(dú)滅活細(xì)菌的游離和生物膜細(xì)胞時(shí)，不能達(dá)到理想的滅菌效果。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)超聲單獨(dú)處理金黃色葡萄球菌15 min，僅使金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)降低0.31 lg（CFU/mL）。許多研究人員研究了超聲與化學(xué)抑菌劑聯(lián)合處理的殺菌效果。遲媛等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合次氯酸鈉具有明顯的協(xié)同殺菌效果，當(dāng)二者聯(lián)合處理時(shí)會(huì)對菌體造成更為嚴(yán)重的損傷。Park 等[15]研究發(fā)現(xiàn)0.15%富馬酸聯(lián)合頻率為40 kHz 超聲，可顯著降低蘋果汁中的大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌數(shù)量。上述研究說明超聲聯(lián)合化學(xué)抑菌劑處理具有明顯的協(xié)同殺菌作用。乳酸是一種羧酸，屬于α-羥酸，主要通過降低微生物所生活的環(huán)境中的pH 來抑制微生物的生長代謝，從而達(dá)到殺菌的目的[16]。有研究表明，5%乳酸可顯著滅活牛肉中的大腸桿菌[17]。Li 等[18]研究發(fā)現(xiàn)1%，1.5%和2%乳酸可使雞蛋表面的腸炎沙門氏菌降到檢測限以下。王鳳婷等[19]當(dāng)使用1%乳酸處理陰溝腸桿菌游離細(xì)胞30 min 時(shí)，可完全殺死該細(xì)胞。劉亞文等[20]用乳酸（1.25，2.50 mg/mL）處理，使陰溝腸桿菌生物膜的生長受到嚴(yán)重的抑制。然而，關(guān)于超聲聯(lián)合乳酸處理的抗菌和抗生物膜機(jī)制還未見報(bào)道。本文以腐敗雞肉中分離的沙門氏菌為目標(biāo)菌株，研究超聲聯(lián)合乳酸處理對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的殺菌和作用，為沙門氏菌及其生物膜的控制提供一個(gè)新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙門氏菌（Salmonella）為本實(shí)驗(yàn)室從腐敗的肉制品中分離獲得。

BHI 腦心浸液肉湯和固體培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；乳酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉和氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；增強(qiáng)型ATP 檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒和NuncTMLab-TekTM8 孔腔室蓋玻片系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司；24 孔聚氯乙烯培養(yǎng)板，美國康寧公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE（Ultra View VOX）轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡，美國珀金埃爾默股份有限公司；EVO-LS10 掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司股份公司；KQ-800KD 超聲清洗機(jī)，中國昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將分離到的沙門氏菌按1∶100的比例接種于新鮮的腦心浸液肉湯 （Brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，隨后將對數(shù)期的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的BHI 培養(yǎng)基中，反復(fù)轉(zhuǎn)接3 次，然后，將菌液與50%的無菌甘油按照1 ∶1 的比例混合后保存到-80 ℃冰箱中。每次試驗(yàn)前，將沙門氏菌菌液按照1∶100 的比例接種于無菌的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，置于4 ℃條件下備用[19-20]。

1.3.2 殺菌處理

1.3.2.1 游離菌體的殺菌 將培養(yǎng)至對數(shù)期的沙門氏菌菌液置于4 ℃條件下，5 000 r/min，離心10 min。去除上清，菌泥用0.85%的生理鹽水洗滌2次。試驗(yàn)分為4 組，第1 組：超聲單獨(dú)（Ultrasound，US，400 W，50 kHz）處理，向菌泥中加入等量的0.85%的生理鹽水，然后置于超聲清洗機(jī)中殺菌處理；第2 組：乳酸（0.5%LA，1%LA）單獨(dú)處理，分別向菌泥中加入等量的0.5%或1%的乳酸；第3 組：超聲聯(lián)合乳酸（US+0.5%LA，US+1%LA）處理，分別向菌泥中加入等量的0.5%或1%乳酸，混勻后立刻置于超聲清洗機(jī)中（400 W，50 kHz）；第4 組：對照組，在獲得的菌泥中加入等量的0.85%的生理鹽水，不做任何處理。所有試驗(yàn)組需設(shè)置3 個(gè)平行樣，分別在第5，10，20，30，60 分鐘取樣。樣品內(nèi)菌落的計(jì)數(shù)方法如下，取1 mL 菌液加入9 mL 無菌的0.1 mol/L PBS 中，按10 倍稀釋法梯度稀釋，隨后選擇適合的梯度，吸取1 mL 菌液加入平板，倒入47 ℃的BHI 固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固，將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。

1.3.2.2 生物膜的殺菌 將培養(yǎng)至對數(shù)期的沙門氏菌按照1∶100 的比例添加到新鮮的BHI 液體培養(yǎng)基中，然后按每孔1 mL 規(guī)格加入24 孔聚氯乙烯培養(yǎng)板中，37 ℃條件下培養(yǎng)72 h，每隔24 h 更換1 次培養(yǎng)基[20]。將生物膜用無菌的0.01 mol/L PBS 洗滌3 次。試驗(yàn)共分為4 組，第1 組：超聲單獨(dú)（US，400 W，50 kHz）處理，向生物膜中加入1 mL 無菌的0.01 mol/L PBS，置于超聲清洗機(jī)中殺菌處理，殺菌時(shí)間分別設(shè)置為5，10，20，30，60 min；第2 組：乳酸（0.5%LA，1%LA）單獨(dú)處理，分別向生物膜中加入1 mL 0.5%或1%的乳酸，殺菌處理，處理時(shí)間分別為5，10，20，30，60 min；第3組：超聲聯(lián)合乳酸（US+0.5%LA，US+1%LA）處理，分別向生物膜中加入1 mL 乳酸 （0.5%LA，1%LA），立刻置于超聲清洗機(jī)中（400 W，50 kHz），殺菌時(shí)間分別設(shè)置為5，10，20，30，60 min；第4 組：對照組，向生物膜中加入1 mL 無菌0.01 mol/L PBS，不做任何處理，第5，10，20，30，60 分鐘取樣。處理結(jié)束后，用滅菌的棉簽刮擦24 孔聚氯乙烯培養(yǎng)板孔壁和底部，將生物膜及孔內(nèi)溶液一起收集至9 mL 無菌的0.1 mol/L PBS 中，終止反應(yīng)。生物膜菌落計(jì)數(shù)方法參考1.3.2.1 節(jié)游離菌體的菌落計(jì)數(shù)方法。

1.3.3 菌體的細(xì)胞形態(tài)觀察 采用掃描電子顯微鏡觀察沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化。沙門氏菌游離細(xì)胞的殺菌方法參考1.3.2.1節(jié)。將對照組和處理組的沙門氏菌游離細(xì)胞體置于4 ℃條件下6 000 r/min 離心5 min，去上清液，將離心所得菌泥用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛在4℃條件下固定12 h。

沙門氏菌生物膜培養(yǎng)和殺菌方法參考1.3.2.2節(jié)。將對數(shù)期的沙門氏菌菌液按1∶100 比例接種于新鮮BHI 液體培養(yǎng)基中，按照每孔400 μL 規(guī)格加入NuncTMLab-TekTM8 孔腔室蓋玻片中，培養(yǎng)72 h，每24 h 更換培養(yǎng)基。將經(jīng)不同處理以及對照組生物膜用0.01 mol/L PBS 洗滌3 次，置于超凈工作臺(tái)中晾干。移除隔板，用2.5%戊二醛在4℃條件下固定12 h[21]。

1.3.4 細(xì)胞膜完整性和通透性觀察 激光共聚焦電鏡主要用于觀察超聲聯(lián)合乳酸處理后對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性和通透性的影響。沙門氏菌游離細(xì)胞菌泥收集方法參考1.3.3節(jié)。將收集的菌泥用LIVE/DEAD BacLightTM試劑避光染色30 min。染色結(jié)束后，用0.85%生理鹽水洗去多余探針，然后用2.5%戊二醛固定30 min。固定結(jié)束后吸出戊二醛，將菌泥重懸于0.85%生理鹽水中。

沙門氏菌生物膜的培養(yǎng)及處理方法參考1.3.3 節(jié)。將處理組與對照組的生物膜用LIVE/DEAD BacLightTM試劑避光染色30 min，染色結(jié)束后，吸出染色液，用0.01 mol/L PBS 輕輕洗去多余探針，用2.5%戊二醛固定30 min。之后，吸出戊二醛，將生物膜晾干。去除孔間隔板，然后通過激光共聚焦電鏡觀察生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性變化[21-22]。

1.3.5 呼吸鏈脫氫酶活性的測定 三苯基四氮唑氯化物（TTC）試驗(yàn)是一種用來測定細(xì)胞中呼吸鏈脫氫酶活性的重要方法[23]。將處理組與對照組的沙門氏菌游離菌體或生物膜菌液1 mL 與2 mL（0.05 mol/L）Tris-HCl 緩沖液（pH=8.6），2 mL（0.1 mol/L）葡萄糖溶液和2 mL（1 mg/mL）TTC 溶液混合，然后，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后向每個(gè)試管中加入2 滴濃縮的硫酸終止反應(yīng)。最后，將溶液與5 mL 石油醚混合后萃取有機(jī)相，測定其在波長490 nm 處的吸光值。

1.3.6 胞外ATP 濃度的測定 沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的培養(yǎng)及處理方法參考1.3.2.1 節(jié)和1.3.2.2 節(jié)。將沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞在4 ℃條件下，5 000 r/min 離心5 min，留上清液，并將上清液放置于冰上保存。沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光值的測量方法按照ATP 試劑盒上的說明書[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，所有試驗(yàn)樣本均設(shè)置3 個(gè)平行樣。采用SPSS 26.0 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲聯(lián)合乳酸處理對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的殺菌效果

超聲、乳酸以及兩者聯(lián)合處理對沙門氏菌游離細(xì)胞的殺菌效果見表1。沙門氏菌游離細(xì)胞的初始菌數(shù)約9 lg（CFU/mL），經(jīng)US 處理60 min 后沙門氏菌游離細(xì)胞的活菌數(shù)僅降低0.43 lg（CFU/mL），而經(jīng)0.5%LA 和1%LA 處理60 min，使得沙門氏菌游離菌細(xì)胞的活菌數(shù)降到檢測限以下，這說明與超聲相比，乳酸殺菌效果相對較好。經(jīng)US+0.5%LA 處理30 min 后，沙門氏菌游離細(xì)胞的菌數(shù)降低6.88 lg（CFU/mL），殺菌效果顯著優(yōu)于單一處理組 （P＜0.05）。此外，經(jīng)US+1%LA 處理20 min，可使沙門氏菌游菌細(xì)胞菌數(shù)降到檢測限以下，而經(jīng)1%LA 處理60 min 才能達(dá)到相同的效果，說明聯(lián)合處理可以提高殺菌效率，縮短殺菌時(shí)間。

表1 不同處理對沙門氏菌游離菌體細(xì)胞的殺菌效果Table 1 Inactivation of Salmonella planktonic cells by different treatments

超聲、乳酸以及兩者聯(lián)合處理對沙門氏菌生物膜細(xì)胞的殺菌效果見表2。沙門氏菌生物膜細(xì)胞初始菌數(shù)約9 lg（CFU/mL），經(jīng)US 處理60 min，生物膜細(xì)胞的菌數(shù)與對照組相比只降低0.33 lg（CFU/mL），而經(jīng)0.5%LA 和1%LA 處理60 min，沙門氏菌生物膜細(xì)胞的菌數(shù)分別下降4.21 lg（CFU/mL）和5.79 lg（CFU/mL）。此外，經(jīng)US+1%LA 處理60 min，使得生物膜細(xì)胞的菌落存活數(shù)降到檢測限以下，而單獨(dú)的超聲和乳酸處理在60 min 的處理時(shí)間內(nèi)都未達(dá)到該殺菌效果。經(jīng)US+0.5%LA 處理60 min，沙門氏菌生物膜細(xì)胞菌數(shù)下降5.87 lg（CFU/mL），而經(jīng)1%LA 單獨(dú)處理60 min，沙門氏菌生物膜細(xì)胞菌數(shù)下降5.78 lg（CFU/mL）。超聲協(xié)同低濃度乳酸處理組的殺菌效果達(dá)到高濃度乳酸的殺菌效果，說明超聲聯(lián)合乳酸處理可以降低使用乳酸的濃度，二者聯(lián)合處理具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。

表2 不同處理對沙門氏菌生物膜菌體細(xì)胞的殺菌效果Table 2 Inactivation of Salmonella biofilm cells by different treatments

2.2 掃描電鏡下沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的菌體形態(tài)

掃描電鏡下沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的菌體形態(tài)變化如圖1所示，對照組的沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞呈飽滿的桿狀，表面光滑且無破損（圖1A1，1B1）。經(jīng)US 處理30 min，菌體開始出現(xiàn)輕微的破損，表面開始褶皺，變粗糙，然而，仍具有完整的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖（1A2，1B2）。經(jīng)1%LA 處理30 min，菌體表面開始出現(xiàn)孔洞，菌體細(xì)胞變形凹陷（圖1A3，1B3）。經(jīng)US+1%LA 處理30 min，菌體表面出現(xiàn)孔洞，菌體細(xì)胞開始黏附在一起，內(nèi)容物大量泄露，大部分菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)被完全破壞（圖1A4，1B4）。這說明US+1%LA 協(xié)同處理對菌體的損傷程度明顯高于單獨(dú)的US 和1%LA 處理。

圖1 不同處理的沙門氏菌游離（A）和生物膜（B）菌體的掃描電鏡拍攝圖Fig.1 SEM images of different treatments on Salmonella planktonic （A） and biofilm cells （B）

2.3 激光共聚焦電鏡下沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的菌體形態(tài)

沙門氏菌游離和生物膜菌體細(xì)胞的激光共聚焦電鏡圖見圖2。未經(jīng)任何處理的沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞在顯微鏡下幾乎全部呈綠色，說明未處理的細(xì)胞膜均是完整的，且其通透性未發(fā)生改變（圖2A1，2B1）。經(jīng)US 處理30 min，極少部分的游離和生物膜菌體細(xì)胞呈紅色，表明US 處理僅造成少部分菌體細(xì)胞膜的損傷（圖2A2，2B2）。經(jīng)1%LA 處理30 min，多數(shù)游離和生物膜菌體呈紅色熒光，少數(shù)菌體依然為綠色，說明乳酸處理造成大部分菌體細(xì)胞損傷，破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜通透性改變（圖2A3，2B3）。經(jīng)US+1%LA 協(xié)同處理，絕大部分菌體死亡，呈紅色，僅有極少數(shù)菌體呈綠色（圖2A4，2B4），說明協(xié)同處理對菌體細(xì)胞的損傷程度最高，協(xié)同處理組對菌體細(xì)胞膜的破壞程度顯著高于單一處理組。

圖2 不同處理的沙門氏菌游離（A）和生物膜（B）菌體的激光共聚焦電鏡拍攝圖Fig.2 CLSM images of different treatments on Salmonella planktonic （A） and biofilm cells （B）

2.4 呼吸鏈脫氫酶活性

通過觀察490 nm 波長處吸光值的變化來研究超聲聯(lián)合乳酸處理對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞中呼吸鏈脫氫酶的抑制作用。如圖3所示，對照組的沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞在490 nm 波長處的吸光值分別為0.336 和0.371。經(jīng)US，1%LA以及US+1%LA 處理30 min，沙門氏菌游離細(xì)胞在490 nm 波長處吸光值分別為0.300，0.076 和0.059，沙門氏菌生物膜在490 nm 波長處吸光值分別為0.347，0.139 和0.091。這表明超聲、乳酸、超聲協(xié)同乳酸都對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞內(nèi)的呼吸鏈脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，且3 種處理方式對呼吸鏈脫氫酶活性的抑制作用具有顯著性差異（P＜0.05）。超聲聯(lián)合乳酸處理后，沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞內(nèi)的呼吸鏈脫氫酶活性下降最多，乳酸單獨(dú)處理其次，超聲聯(lián)合處理酶的活性下降最少，說明乳酸對酶活的影響明顯高于超聲，且超聲聯(lián)合乳酸處理對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞內(nèi)的呼吸鏈脫氫酶活性的抑制作用明顯高于單一處理組。

圖3 不同處理的沙門氏菌游離（a）和生物膜（b）細(xì)胞呼吸鏈脫氫酶酶活性變化Fig.3 The activity of RCD in Salmonella planktonic （a） and biofilm cells （b） after different treatments

2.5 胞外ATP 濃度

胞外ATP 濃度的增加反映細(xì)菌細(xì)胞膜完整性受到破壞。如圖4所示，未經(jīng)任何處理的沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的胞外ATP 濃度分別為6.30 nmol/mL 和7.37 nmol/mL。經(jīng)US，LA 以及US+LA 處理30 min，沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的胞外ATP 濃度明顯增加，說明處理后菌體細(xì)胞膜的通透性增加，聯(lián)合處理組的胞外ATP 濃度顯著高于相同條件下的單一處理組 （P＜0.05），且US+1%LA 處理組的胞外ATP 濃度顯著高于其它處理組（P＜0.05），這說明US+1%LA 可快速破壞沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜，造成胞內(nèi)ATP 濃度的釋放。

圖4 不同處理的沙門氏菌游離（a）和生物膜（b）細(xì)胞胞外ATP 變化Fig.4 The release of ATP in Salmonella planktonic （a） and biofilm cells （b） after different treatments

3 討論

超聲聯(lián)合乳酸對沙門氏菌游離和生物膜細(xì)胞具有明顯的協(xié)同殺菌作用，效果明顯優(yōu)于單一處理，這主要?dú)w因于超聲導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生亞致死損傷，促進(jìn)乳酸更好地進(jìn)入細(xì)胞，從而達(dá)到協(xié)同殺菌的目的[24]。事實(shí)上，超聲協(xié)同化學(xué)抑菌劑具有明顯的協(xié)同殺菌效應(yīng)，如Zhang 等[25]報(bào)道，超聲聯(lián)合天然化合物在抑制大腸桿菌和單細(xì)胞增生李斯特菌的生長方面具有明顯的協(xié)同效應(yīng)；Shao 等[26]報(bào)道，酸性電解水的單一處理只將細(xì)菌菌數(shù)降低3.0l lg（CFU/mL），而酸性電解水與超聲結(jié)合可以減少4.8l lg（CFU/mL）。Yu 等[27]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲波（HIU，20 kHz，60 W）和二氧化氯（4 mg/L）的結(jié)合對金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞的失活有明顯的協(xié)同作用。Guo 等[28]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)超聲或百里香精油納米乳使大腸桿菌菌落總數(shù)分別減少0.69，4.13 lg（CFU/mL），超聲與百里香精油納米乳液聯(lián)合處理可將大腸桿菌菌落總數(shù)減少7.42 lg（CFU/mL）。然而，目前關(guān)于超聲聯(lián)合乳酸處理的協(xié)同殺菌效果未見報(bào)道。

超聲聯(lián)合乳酸處理可顯著增加細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性以及破壞細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致胞外ATP 泄露增加，這主要?dú)w因于超聲可以幫助乳酸快速進(jìn)入細(xì)胞，從而迅速破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜。此外，超聲聯(lián)合乳酸處理還破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌呼吸鏈脫氫酶的降低。Liu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸聯(lián)合酸性電解水具有明顯的協(xié)同殺菌作用，二者聯(lián)合處理時(shí)可迅速破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜的完整性，引起ATP 的泄露。Liu 等[30]研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸可以迅速破壞陰溝腸桿菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致ATP 與胞內(nèi)大分子物質(zhì)的泄露。王鳳婷等[19]研究中發(fā)現(xiàn)1%乳酸使得陰溝腸桿菌胞外ATP 濃度顯著增加。Liu 等[31]報(bào)道，隨著芳樟醇濃度的增加，綠膿桿菌呼吸鏈脫氫酶活性逐漸降低。林祎[23]報(bào)道，超聲輔助熱處理可顯著降低沙門氏菌和單增李斯特菌的呼吸鏈脫氫酶活性。以上研究表明，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性受到破壞時(shí)引起細(xì)胞ATP 的泄露和呼吸鏈脫氫酶活性降低，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，超聲單獨(dú)殺菌效果不明顯，對細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷，然而這種損傷不足以導(dǎo)致細(xì)菌死亡。當(dāng)超聲聯(lián)合乳酸處理時(shí)，超聲促進(jìn)乳酸進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)菌的細(xì)胞膜嚴(yán)重?fù)p傷，引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露，導(dǎo)致菌體死亡。綜上，超聲聯(lián)合乳酸處理可縮短殺菌時(shí)間，降低殺菌時(shí)使用乳酸的濃度，且二者聯(lián)合處理可顯著提高殺菌效率。

4 結(jié)論

研究了超聲聯(lián)合乳酸處理對沙門氏菌游離及生物膜細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明超聲，0.5%，1.0%乳酸均有殺菌效果，其中超聲聯(lián)合乳酸的殺菌效果最好，二者具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。掃描電鏡結(jié)果表明，超聲聯(lián)合乳酸處理后，細(xì)菌菌體結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，大部分細(xì)胞無完整的菌體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描電鏡結(jié)果表明，超聲聯(lián)合乳酸處理可顯著增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。胞外ATP 濃度增加較明顯，說明二者聯(lián)合處理可顯著破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。此外，超聲聯(lián)合乳酸處理顯著降低了細(xì)胞呼吸鏈脫氫酶的活性。綜上，超聲聯(lián)合乳酸處理主要通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞外ATP 濃度升高及細(xì)胞呼吸鏈脫氫酶活性降低，最終達(dá)到殺菌的目的。