李 喆 蔣 靜 王 楊 周玉超 余 樂 婁麗璇 許書添 李世軍

慢性腎臟病(CKD)患者常需要接受免疫抑制劑治療[1],可能導(dǎo)致機體物理屏障、特異性及非特異性免疫系統(tǒng)受損,對各類病原體的易感性增加[2],嚴重影響預(yù)后,其中感染已成為狼瘡性腎炎(LN)患者的首要死因[3]。

目前,常用的病原體檢測方法均存在一定的缺陷[4]。宏基因組二代測序(mNGS)可直接從樣本中提取全部微生物的核酸進行高通量測序,快速客觀地檢測病原體,與常規(guī)微生物學(xué)檢測(CMT)相比,mNGS無偏倚、廣覆蓋、無需先證[5]。自2014年首次幫助1例嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥少年確診鉤端螺旋體性腦炎以來[6],在不明原因發(fā)熱[7]、膿毒癥[8]、器官及干細胞移植[9]等患者的血液、腦脊液、痰及肺泡灌洗液(BALF)等標本中均展現(xiàn)了良好的檢測效率。目前尚無mNGS在CKD感染患者的臨床應(yīng)用研究,本研究回顧性分析腎臟重癥監(jiān)護病房(ICU)收治的疑診感染患者,與CMT對比,評估m(xù)NGS檢測能力,探索mNGS在CKD免疫抑制患者感染鑒別診斷中的應(yīng)用價值。

對象和方法

研究對象回顧性分析2018年8月至2022年4月國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心ICU收治的疑診感染,院外抗感染療效不佳的CKD免疫功能低下患者。疑診感染依據(jù):(1)持續(xù)腋下體溫≥37.3℃;(2)有咳嗽、咳痰、胸悶、乏力、皮膚紅腫、腹痛、腹瀉、頭痛、尿急、尿痛等感染臨床癥狀;(3)C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)等炎癥指標升高;(4)胸片、CT、心臟超聲等影像學(xué)檢查存在疑似感染灶。免疫抑制依據(jù):(1)CD4+T細胞計數(shù)<200個/μL;(2)腎或造血干細胞移植;(3)感染前潑尼松20 mg/d治療>14 d,或潑尼松累積劑量>600 mg;(4)接受其他免疫抑制劑治療[10]。所有患者在接受抗感染藥物治療前根據(jù)臨床需求,接受CMT檢測(包括血、痰、BALF、鼻咽拭子、穿刺液培養(yǎng),微生物學(xué)抗原抗體,細菌、真菌、病毒相關(guān)生物標志物等),無菌原則下采集送檢樣本,培養(yǎng)和mNGS標本同時送檢。

排除標準:(1)入院3天內(nèi)死亡或放棄治療,CMT結(jié)果不完整;(2)入院時已明確感染病原體,抗感染明顯起效;(3)抗感染后復(fù)查的mNGS結(jié)果;(4)不明原因發(fā)熱,在院期間未找到明確發(fā)熱原因。符合上述標準的患者分別為CMT確認感染組、臨床診斷感染組和排除感染組進一步分析。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號2022DZKY-033-01)。

統(tǒng)計學(xué)方法使用《SPSS 26.0》軟件進行數(shù)據(jù)分析,本研究計量資料均為偏態(tài)分布,以中位數(shù)(四分位間距)表示。三組間數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis H檢驗,發(fā)現(xiàn)三組間存在差異時,采用Bonferroni法校正后再進行組間兩兩比較。計數(shù)資料以百分比表示,組間比較用χ2檢驗或者Fisher精確檢驗。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般資料共納入303例患者,男性186例(61.39%),中位年齡49(34,60)歲。原發(fā)疾病包括腎移植術(shù)后72例,LN 56例,膜性腎病34例,慢性腎功能不全33例,抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)腎炎和腎病綜合征各20例,IgA腎病13例,足細胞病11例,冷球蛋白血癥性腎小球腎炎8例,腎淀粉樣變性、糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、抗腎小球基膜(GBM)腎炎各5例,具有腎臟意義的單克隆球蛋白病、常染色體顯性遺傳多囊腎病各3例,POEMS綜合征、IgM腎病、過敏性紫癜性腎炎、干燥綜合征腎損害各2例,多發(fā)性骨髓瘤腎損害、膜增生性腎小球腎炎各1例。35例合并2型糖尿病、22例合并類固醇性糖尿病。CKD起病至本次入院前,累計使用2 (1,3)種免疫抑制劑,中位治療時間7 (2,50)月。入院前2月48例患者曾接受大劑量免疫抑制劑(如甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗)沖擊治療,253例服用潑尼松,中位劑量20(5, 30)mg/d。

51例(16.83%)患者符合《膿毒癥3.0診斷標準》[11],感染部位包括肺部221例、皮膚25例、腹腔24例、胸腔18例、血流16例、尿路13例、胃腸道9例、顱內(nèi)5例、感染性心內(nèi)膜炎及結(jié)核性心包炎各1例。62例(20.46%)患者在院期間死亡。

三組臨床資料比較165例通過CMT找到感染病原體為CMT確診感染組;104例臨床考慮感染,但CMT未找到感染病原體為臨床診斷感染組;34例入院初期疑診感染,后找到其他非感染發(fā)熱原因為排除感染組(圖1)。三組患者免疫抑制劑使用時間、累計免疫抑制劑總數(shù)、近2月潑尼松比例和劑量、入院體溫、總淋巴細胞計數(shù)、CD4+T細胞計數(shù)、IgG、CRP、在院死亡率組間存在明顯差異,其中排除感染組的免疫抑制劑使用時間、累計免疫抑制劑總數(shù)、入院體溫、在院死亡率均低于CMT確診感染組,而總淋巴細胞計數(shù)和IgG均高于CMT確診感染組(P<0.05)(表1)。

圖1 患者篩選流程mNGS:宏基因組二代測序;CMT:常規(guī)微生物學(xué)檢測

表1 3組患者臨床資料比較

CMT:常規(guī)微生物學(xué)檢測;ICU:重癥監(jiān)護室;WBC:白細胞;PLT:血小板;TLC:總淋巴細胞計數(shù);TNC:總中性粒細胞計數(shù);IgG:免疫球蛋白G;PCT:降鈣素原;CRP:C反應(yīng)蛋白;P:三組間比較;P1:CMT確診感染組與臨床診斷感染組比較;P2:臨床診斷感染組與排除感染組比較;P3:CMT確診感染組與排除感染組比較

mNGS與CMT檢測結(jié)果165例CMT確診感染組中64例mNGS與CMT結(jié)果完全一致,46例部分一致,55例不一致。104例臨床診斷感染組中60例可通過mNGS發(fā)現(xiàn)感染病原體。兩組感染患者共86例根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整抗生素治療。34例排除感染組有29例CMT和mNGS雙陰性,其中合并彌漫性肺泡出血、自身免疫性溶血性貧血、嗜血細胞綜合征、可逆性后部腦白質(zhì)病變各3例,血栓性血小板減少性紫癜2例,骨髓增生異常綜合征、藥物超敏綜合征、抗磷脂抗體綜合征、格林巴利綜合征、間質(zhì)性肺病各1例(圖2)。

圖2 mNGS與CMT總體分布對比mNGS:宏基因組二代測序;CMT:常規(guī)微生物學(xué)檢測;(+):陽性;(-):陰性

本研究303例患者mNGS結(jié)果中,無病原體50例,真菌121例,革蘭陽性菌54例、革蘭陰性菌86例。2例在腦脊液中分別發(fā)現(xiàn)人皰疹病毒1型和JC多瘤病毒,確診為單純皰疹病毒性腦炎和可逆性胼胝體壓部綜合征。mNGS與培養(yǎng)在不同病原體檢測分布見圖3,其中85例肺孢子菌屬、23例曲霉屬、9例軍團菌屬、8例酵母屬、6例羅氏菌屬、4例鏈格孢屬,以及10例結(jié)核分支桿菌、7例非結(jié)核分支桿菌、1例鸚鵡熱衣原體僅能通過mNGS鑒定。

圖3 mNGS與培養(yǎng)在不同病原體檢測分布對比mNGS:宏基因組二代測序;(+)陽性;(-):陰性

mNGS與培養(yǎng)的檢測一致性本研究患者血液、BALF、深部痰液、漿膜腔積液、腦脊液等標本mNGS與培養(yǎng)的細菌、真菌一致性檢驗,Kappa值分別為0.043、0.158、0.055、0.051、0.615,一致性分別為47.53%、62.50%、40.0%、33.33%、90.0%。與培養(yǎng)相比mNGS報陽時間更早,檢測細菌、真菌種類更多(P<0.05)(表2),2種以上的細菌及真菌混合感染檢出率,mNGS高于培養(yǎng)(24.42%vs3.30%，P<0.001)。

表2 不同送檢標本mNGS與培養(yǎng)報陽時間和檢測感染病原體種類對比

mNGS與CMT檢測效率對比本研究mNGS對感染病原體檢測靈敏度和準確度強于CMT(P=0.014),而特異度、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)均無明顯差異(表3)。

表3 mNGS與CMT診斷效率對比

討 論

目前已知感染性疾病的病原體高達上萬種,CMT僅能覆蓋一小部分常見病原體,檢測結(jié)果依賴醫(yī)師判斷和實驗室水平[12]。此外經(jīng)驗性抗生素治療造成假陰性,體液采樣不充分、病原體載量少、培養(yǎng)周期長,胞內(nèi)菌、苛養(yǎng)菌、病毒不可培養(yǎng)等因素,造成工作中較多感染無法明確病原體[13]。而服用免疫抑制劑的CKD患者,常見病原體感染時部分臨床表現(xiàn)與普通人群存在差異,是罕見病原體的易感者和新發(fā)病原體感染的“前哨兵”,更需早期得到初始有效的抗感染治療。

mNGS因其敏感、快捷、高效的優(yōu)勢,在診斷疑難感染的同時也存在一些爭議[14]。華山醫(yī)院在服用糖皮質(zhì)激素的免疫抑制患者中發(fā)現(xiàn)，血液、BALF、穿刺液等多樣本送檢mNGS,對感染診斷的靈敏度和特異度分別為80.6%和87.1%,其結(jié)果不受免疫抑制程度影響,利用mNGS指導(dǎo)抗生素治療成功率顯著高于經(jīng)驗性治療(81.8%vs52.6%)[15]。美國圣裘德兒童研究醫(yī)院發(fā)現(xiàn)在血流感染發(fā)病的前3天,血液mNGS就可以提前發(fā)現(xiàn)感染病原體,其預(yù)測靈敏度為75%,特異度為91%[16]。但美國德克薩斯州兒童醫(yī)院發(fā)現(xiàn)CMT與mNGS結(jié)果基本相同,幾乎沒有提高診斷價值。當mNGS鑒定出其他病原體時,僅26%的患者調(diào)整了抗生素[17]。我國專家共識推薦對于臨床疑似感染的危重或免疫抑制患者,在完善CMT同時,采集疑似感染部位的標本送檢mNGS,當原發(fā)感染灶病原學(xué)檢測陰性或無法送檢適合標本的情況下,可送檢血液作為二線檢測方法[18]。

國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心既往研究發(fā)現(xiàn)通過血液mNGS診斷耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)的特異度顯著高于CMT[19]。mNGS檢測巨細胞病毒混合感染有助于評估PJP患者的免疫抑制水平和危重程度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS能提高免疫功能低下的CKD患者感染病原體檢測的靈敏度、準確度和混合感染檢出率,縮短報陽時間,可快速發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子菌、曲霉菌、結(jié)核分枝桿菌、軍團菌等難以培養(yǎng)的病原體和馬爾尼菲籃狀菌、諾卡菌、非結(jié)核分枝桿菌、鸚鵡熱衣原體等罕見病原體,展現(xiàn)了重要臨床應(yīng)用價值。

本研究發(fā)現(xiàn)mNGS和CMT的特異度、PPV、NPV無明顯差異,NPV均偏低,42.31%的臨床診斷感染組患者不能通過mNGS找到病原體,僅憑mNGS陰性并不能排除感染。ANCA相關(guān)腎炎和LN活動時CRP等炎癥指標升高[21],部分抗GBM腎炎患者以發(fā)熱為起病表現(xiàn)[22],彌漫性肺泡出血與肺部感染的胸部CT表現(xiàn)難以鑒別。上述CKD患者需要結(jié)合病史、癥狀、體征、實驗室及影像學(xué)檢查,結(jié)合多部位病原體檢測結(jié)果綜合評估,才能決定強化抗生素亦或加大免疫抑制劑量。本研究發(fā)現(xiàn)血液、BALF、深部痰液、漿膜腔積液等標本mNGS與培養(yǎng)的檢測一致性均偏低,腦脊液的細菌、真菌檢測一致性雖達90.0%,但仍有2例患者僅能通過mNGS確診顱內(nèi)病毒感染,部分患者的念珠菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌等病原體不能通過mNGS鑒定,而培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn),提示mNGS檢測方法的穩(wěn)定性有待進一步提高,兩種檢測方法互為補充,需要聯(lián)合應(yīng)用,而非替代關(guān)系。

理論上mNGS具有檢測宿主中任何微生物的能力,可以預(yù)見將來在感染前病原體定植鑒定、宿主和微生物基因表達分析、治療后病原體負荷和抗生素耐藥性、醫(yī)院獲得性血流感染風險評估、甚至疫情調(diào)查和識別傳播途徑等方面應(yīng)用前景廣泛[23]。后續(xù)我們將探索mNGS能否預(yù)測導(dǎo)管相關(guān)血流感染,對條件致病微生物在不同免疫狀態(tài)和CKD嚴重程度中的變化進行深入研究[24]。

本研究為單中心回顧性研究,對感染的臨床診斷具有一定主觀性,未納入入院前感染病原體已明確的患者,對本研究的檢測效率評估有一定干擾。近年來mNGS檢測技術(shù)不斷改進和微生物大數(shù)據(jù)庫的即時更新,對該檢測手段的一致性存在一定影響。

綜上所述,mNGS能增加免疫功能低下CKD患者感染病原體檢測的靈敏度和準確度,縮短報陽時間,提高混合感染、機會性感染、罕見感染病原體檢出率,有助于準確、及時地調(diào)整藥物治療,展現(xiàn)了重要臨床應(yīng)用價值。