孫 欣 張 濤 綜述 唐 亮 審校

腎移植是治療終末期腎病的首選方法。移植腎功能損傷主要與排斥反應(yīng)、免疫抑制藥物毒副作用及移植物腎病有關(guān)。血清肌酐、尿素氮、肌酐清除率、尿蛋白等實驗室監(jiān)測指標常用于反映監(jiān)測移植腎損傷,但存在一定滯后性[1],在發(fā)生明顯腎損傷時才會發(fā)生變化,難以作為早期精準診斷及評估預(yù)后的標準。移植腎活檢是鑒定移植腎損傷病因的“金標準”,其有創(chuàng)性可能造成出血及移植器官損傷等并發(fā)癥,同時病理報告的延時性及活檢部位差異可能導(dǎo)致的結(jié)果不確定性也為移植腎損傷臨床早期診斷及治療帶來不少困難[2]。因此,尋找能夠無創(chuàng)、早期且準確診斷移植腎損傷的生物標志物,不僅能對疾病進行早期干預(yù),還可對診療措施進行客觀評判,正逐漸成為當(dāng)今腎移植領(lǐng)域研究的熱點。研究表明供體來源細胞游離DNA(donor-derived cell-free DNA,dd-cfDNA)在監(jiān)測移植腎損傷,尤其是在監(jiān)測移植腎排斥反應(yīng)方面有重要意義[2]。dd-cfDNA是一種源于供體的碎片化、可降解DNA片段,是一種監(jiān)測移植物損傷的新型、無創(chuàng)生物標志物。本文著重就dd-cfDNA在腎移植的應(yīng)用價值作一綜述。

細胞游離DNA(cell-free DNA,cf-DNA)

cf-DNA在1948年由法國科學(xué)家Mandel和 Metais發(fā)現(xiàn)。血漿中cf-DNA約90%來源于白細胞,腎臟、肝臟等器官也少量生成。細胞核中DNA纏繞組蛋白形成核小體,當(dāng)細胞凋亡、壞死時,核小體釋放入血,被多種核酸酶剪切形成cf-DNA。壞死產(chǎn)生的cf-DNA片段大,約10 000個堿基對,而凋亡產(chǎn)生的cf-DNA片段小,約170個堿基對。cf-DNA半衰期為30～120 min,其清除機制尚未完全闡明,核酸酶剪切、腎臟代謝及肝臟和脾臟攝取都可能參與[1]。多種因素影響cf-DNA水平,如肥胖、運動、炎癥及腫瘤等[3-6]。肥胖會破壞脂肪細胞肥大和增殖之間的平衡,導(dǎo)致脂肪細胞缺氧、炎癥、凋亡和壞死,進而加速脂肪細胞分泌cf-DNA[3]。運動可提高體內(nèi)cf-DNA水平,且cf-DNA上升幅度與運動的強度及持續(xù)時間有關(guān),具體機制不清,可能涉及壓力因素、細胞壞死及凋亡[4]。膿毒癥和危重感染患者血液中cf-DNA水平升高。 通過整合微生物和機體信息,cf-DNA有望成為膿毒癥的生物標志物,有助于臨床決策[5]。腫瘤細胞壞死或凋亡時產(chǎn)生cf-DNA,又稱為循環(huán)腫瘤DNA,可用于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤,監(jiān)測腫瘤的進展及復(fù)發(fā)[6]。

供體來源細胞游離DNA(dd-cfDNA)

cf-DNA包含多種類型,最主要的有dd-cfDNA,循環(huán)線粒體DNA,循環(huán)腫瘤DNA,循環(huán)胎兒DNA。1998年,Lo等[7]發(fā)現(xiàn)接受男性供體的女性腎及肝移植受者血漿中存在供體特異性cf-DNA,由此開啟了dd-cfDNA相關(guān)研究。dd-cfDNA是在受者血、尿中檢測到的外源性且由移植器官分泌的cf-DNA,只占cf-DNA總量的小部分。dd-cfDNA定量標準有dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA絕對值,其中dd-cfDNA(%)是指dd-cfDNA占受者總cf-DNA的百分比。器官移植初期,受者體內(nèi)dd-cfDNA上升,而后逐步下降至“穩(wěn)定”水平。當(dāng)出現(xiàn)移植器官排斥、缺血再灌注損傷或感染時,受者體內(nèi)dd-cfDNA會迅速升高(圖1)。

圖1 dd-cfDNA在移植腎排斥、缺血再灌注損傷、移植腎感染后水平上升,或是移植腎損傷監(jiān)測的早期生物標志物dd-cfDNA:供體來源細胞游離DNA;可能機制為:同種異體腎移植后,如出現(xiàn)移植腎排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷或移植腎感染,可導(dǎo)致移植腎損傷,促進移植物細胞壞死、凋亡,進而釋放到循環(huán)中的dd-cfDNA數(shù)量明顯增多。后期移植腎損傷進展引起肌酐等升高、尿蛋白陽性,最終造成移植腎失功

dd-cfDNA在腎移植中的應(yīng)用

監(jiān)測移植后排斥反應(yīng)dd-cfDNA可檢測移植后排斥反應(yīng),對鑒別抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(ABMR)和T細胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)(TCMR)有輔助診斷價值[8]。dd-cfDNA是腎移植的預(yù)后標志物和風(fēng)險分層工具,持續(xù)低水平dd-cfDNA或能準確識別同種異體移植物免疫耐受[9]。排斥反應(yīng)治療后引起dd-cfDNA變化,持續(xù)高水平dd-cfDNA可能提示排斥反應(yīng)尚未完全恢復(fù)[10]。ABMR組受者dd-cfDNA(%)明顯高于對照組(2.4%vs0.65%,P<0.001),閾值1%時,敏感性88.9%,特異性73.7%,陽性預(yù)測值(PPV)76.2%,陰性預(yù)測值(NPV)87.5%[11]。ABMR組受者dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA絕對值較TCMR組顯著升高。dd-cfDNA(%)鑒別診斷TCMR和ABMR的曲線下面積(area under the curve,AUC)閾值、敏感性、特異性分別為0.76、1.11%、88.89%、59.52%，而dd-cfDNA絕對值鑒別診斷TCMR和ABMR的AUC、閾值、敏感性、特異性分別為0.74、0.53 ng/mL、88.89%、54.76%[8]。dd-cfDNA能有效鑒別ABMR而非TCMR,且dd-cfDNA(%)高并不代表一定有排斥反應(yīng)。一項回顧性研究納入63例受者行移植腎活檢,共34例急性排斥反應(yīng)(acute rejection,AR)。ABMR,TCMR,活檢陰性組dd-cfDNA(%)分別為1.35%,0.27%,0.38%。29例活檢陰性受者中有8例dd-cfDNA(%)>1%[12]。Halloran等[13]研究表明,dd-cfDNA水平反映排斥反應(yīng)活躍程度,如水平低,代表排斥反應(yīng)發(fā)生概率低,可減少不必要的移植腎活檢。dd-cfDNA(%)與ABMR相關(guān)性最強,與活躍TCMR有關(guān),與不活躍TCMR、腎損傷和萎縮性纖維化無關(guān)。DART研究表明,dd-cfDNA能辨別發(fā)生排斥反應(yīng)的移植腎活檢標本;dd-cfDNA(%)閾值1%時,排斥反應(yīng)的PPV、NPV分別為61%、84%，而ABMA的PPV、NPV分別為44%、96%;dd-cfDNA(%)鑒別ABMR與非ABMR活檢標本的AUC為0.87;ABMR,TCMR≥IB型,TCMR IA型,對照組的dd-cfDNA(%)中位值分別為2.9%,1.2%,0.2%,0.3%[14]。薈萃分析表明,dd-cfDNA水平在TCMR受者與“穩(wěn)定”受者無差異。dd-cfDNA可能是ABMR而非TCMR的生物標志物[15-16]。

供體特異性抗體(DSA)是引發(fā)同種異體移植排斥反應(yīng)的重要原因。高水平dd-cfDNA可促進新生DSA(dnDSA)形成[1]。dd-cfDNA和dnDSA與ABMR密切相關(guān),DSA平均熒光強度(MFI)≥2 500與C4d染色評分、dd-cfDNA>1%與微血管炎癥的關(guān)聯(lián)最強[17]。Cheng等[18]研究表明,dd-cfDNA優(yōu)于DSA,是ABMR特異性指標。DSA-MFI能加強dd-cfDNA檢測效能。dd-cfDNA或是鑒別DSA陽性受者ABMR和其他類型損傷的有效手段。ADMIRAL研究發(fā)現(xiàn)dd-cfDNA(%)比DSA提前91 d升高[9]。受者dd-cfDNA(%)≥0.5%時,dnDSA形成風(fēng)險提高3倍。受者有兩份或以上dd-cfDNA(%)結(jié)果>0.5%可預(yù)測3年內(nèi)估算的腎小球濾過率(eGFR)下降超過25%。dd-cfDNA(%)≥0.5%與臨床和亞臨床排斥反應(yīng)密切相關(guān)[9]。dnDSA陽性受者的dd-cfDNA(%)更高。dd-cfDNA(%)異常升高與dnDSA、eGFR下降相關(guān)。術(shù)后第1年dd-cfDNA(%)≥1%和dd-cfDNA(%)增幅≥0.34%與第2年eGFR下降≥25%有關(guān)[19]。

一項多中心隊列研究首次報告腎移植受者dd-cfDNA的臨床實踐經(jīng)驗,指出dd-cfDNA有助于臨床決策。dd-cfDNA(%)預(yù)測排斥反應(yīng)準確率為64%[20]。QIDNEY研究從側(cè)面證明了dd-cfDNA影響臨床決策。該研究納入美國175名執(zhí)業(yè)腎病?？漆t(yī)生,通過模擬病例資料中有無dd-cfDNA數(shù)據(jù)進行2輪測試。結(jié)果表明,模擬病例引入dd-cfDNA數(shù)據(jù)后,醫(yī)生能及時發(fā)現(xiàn)早期和亞臨床排斥反應(yīng),做出正確處理措施,并適當(dāng)修改治療方案[21]。

排斥反應(yīng)是兒童腎移植術(shù)后常見且難治的并發(fā)癥,導(dǎo)致兒童移植腎丟失率高,亟需新型監(jiān)測手段。dd-cfDNA(%)是識別兒童受者臨床和亞臨床排斥反應(yīng)有用且可靠的指標。dd-cfDNA(%)>1%時,診斷排斥反應(yīng)的敏感度86%,特異度100%,AUC 0.996[23]。dd-cfDNA或是TCMR治療后可靠的隨訪指標。兒童受者排斥反應(yīng)經(jīng)積極治療后dd-cfDNA下降,TCMR組<1.0%,下降最明顯[22]。

監(jiān)測免疫抑制不足受者感染細菌、病毒后需要下調(diào)免疫抑制藥物劑量,加之一部分受者服藥依從性差,導(dǎo)致排斥反應(yīng)發(fā)生率升高。持續(xù)的免疫抑制不足誘導(dǎo)dnDSA形成,加劇移植物丟失風(fēng)險[23]。在監(jiān)測免疫抑制不足引起的亞臨床移植物損傷中,dd-cfDNA或優(yōu)于他克莫司血藥濃度監(jiān)測[1]。腎移植受者dd-cfDNA(%)升高與他克莫司濃度下降有關(guān)。dd-cfDNA與他克莫司相互作用機制未明,有如下假設(shè):移植初期,他克莫司破壞白細胞穩(wěn)定性,加速白細胞凋亡、溶解,導(dǎo)致血漿總cf-DNA增加。后期他克莫司劑量減少,白細胞數(shù)量增加,凋亡減少,存活時間延長,受者自身cf-DNA和總cf-DNA均減少,dd-cfDNA(%)增加[24]。

監(jiān)測移植腎感染性疾病受者感染細菌、病毒時dd-cfDNA作用有待商榷。尿液dd-cfDNA濃度在BK腎病受者中明顯升高,可鑒別BK腎病[2]。而Sigdel等[24]指出,尿液dd-cfDNA濃度無法辨別AR和BK腎病。尿路感染或BK病毒感染時,血漿dd-cfDNA(%)升高[25]。受者罹患BK腎病、BK病毒感染、巨細胞病毒感染或尿路感染時,dd-cfDNA(%)未明顯改變[26]。移植腎發(fā)生腎盂腎炎和腎小管壞死時,dd-cfDNA(%)升高[26-27]。腎小球炎及管周毛細血管炎時,血漿dd-cfDNA(%)升高,而尿液dd-cfDNA(%)與腎小管炎有關(guān)[1]。dd-cfDNA絕對值與腎間質(zhì)炎癥、腎小球炎及管周毛細血管炎的病理Banff評分呈正相關(guān)[27]。

dd-cfDNA在其他器官移植中應(yīng)用

目前單純胰腺移植中尚無有關(guān)dd-cfDNA的研究報道。在胰腎聯(lián)合移植(SPK)中,dd-cfDNA或能監(jiān)測排斥反應(yīng)。dd-cfDNA絕對值閾值為70 cp/mL時,診斷排斥反應(yīng)的敏感度85.7%,特異度93.7%,AUC 0.89,比脂肪酶(AUC 0.74)和淀粉酶(AUC 0.46)更精確,但需移植45 d之后才能有效辨別胰腺移植物AR[28]。97%“穩(wěn)定”SPK受者dd-cfDNA(%)<0.5%。dd-cfDNA(%)可鑒別SPK受體中AR與移植物損傷(胰腺炎)及免疫耐受[29]。肝移植受者因移植物體積大,肝細胞再生率較高,dd-cfDNA基線水平相對較高。dd-cfDNA是肝移植受者早期移植物損傷的敏感標志物。當(dāng)肝移植物損傷時,dd-cfDNA(%)早于肝功能指標提前發(fā)生變化。閾值5.3%時,dd-cfDNA(%)鑒別AR的AUC、PPV、NPV分別為 0.95、87%、100%[30]。單肺移植和雙肺移植中dd-cfDNA基線水平存在差異。dd-cfDNA是肺移植后AR的生物標志物。發(fā)生AR后,dd-cfDNA水平迅速升高,dd-cfDNA(%)中位數(shù)是1.95%。閾值>1%時,dd-cfDNA(%)診斷AR的敏感度、特異度、PPV、NPV、AUC分別為 77%、84%、60%、90%、0.89[31]。dd-cfDNA與心臟移植排斥反應(yīng)顯著相關(guān),與“穩(wěn)定”受者相比,AR受者dd-cfDNA(%)明顯升高(0.38%vs. 0.03%,P<0.001)。dd-cfDNA水平與排斥反應(yīng)的嚴重程度相關(guān)。閾值為0.25%時,dd-cfDNA(%)診斷AR的敏感度、特異度、NPV、AUC分別為81%、85%、99.2%、0.92[32]。

dd-cfDNA研究的不足

dd-cfDNA在腎移植中有廣泛的應(yīng)用前景,但目前研究仍有不足:(1)檢測手段有待優(yōu)化統(tǒng)一。不同dd-cfDNA檢測平臺差異大,測量變異度高,無法互認結(jié)果,有假陽性可能。(2)監(jiān)測方案有待優(yōu)化統(tǒng)一。目前尚無明確的dd-cfDNA監(jiān)測方案。Pai等[33]依據(jù)腎移植后免疫治療時間節(jié)點,闡明術(shù)后第1年第1月、2月、3月、4月、6月、9月、12月及第1年后每季度監(jiān)測dd-cfDNA的臨床工作原理。KOAR研究(NCT033226076,ClincalTrials.gov)計劃在預(yù)定時間點行dd-cfDNA 監(jiān)測及移植腎活檢,有望解決此難題[1]。(3)定量標準有待優(yōu)化統(tǒng)一。dd-cfDNA絕對值和dd-cfDNA(%)的優(yōu)劣性尚有爭議,需進一步研究優(yōu)化定量標準。(4)缺少特異性免疫抑制藥物研究:他克莫司(NCT04225988,ClincalTrials.gov)及托珠單抗(NCT03859388,ClincalTrials.gov)與dd-cfDNA的臨床試驗正在開展[34]。(5)缺少與其他指標如免疫激活標志物GEP、肌酐、DSA、趨化因子CXCL9及CXCL10的聯(lián)合應(yīng)用的研究,以期探索最佳監(jiān)測手段[1,35]。

小結(jié):dd-cfDNA作為一種新型、無創(chuàng)、靈敏度高、可重復(fù)性強的新型生物標志物,有助于早期監(jiān)測移植腎排斥反應(yīng)、免疫抑制不足及移植腎感染性疾病,有利于受者精準化治療隨訪,預(yù)防移植腎過早丟失。盡管當(dāng)前相關(guān)研究存在一定不足,限制其臨床應(yīng)用,但相信隨著臨床理論研究的深入開展,dd-cfDNA或?qū)淖兡I移植臨床實踐,開啟腎移植領(lǐng)域新的紀元。