龔 丞 綜述 劉志紅,2 審校

根據(jù)來源基因突變主要分為生殖系突變與體細(xì)胞突變兩種。生殖系突變通過遺傳獲得,隨著個體發(fā)育傳遞給所有細(xì)胞,其引發(fā)的疾病具有早發(fā)性、全身性的特點(diǎn),并符合家系遺傳模式。體細(xì)胞突變發(fā)生在受精卵形成后及個體生命過程中任意時刻,造成單個細(xì)胞的突變并傳遞給隨之?dāng)U增的單克隆細(xì)胞群,通常不遺傳給后代,由體細(xì)胞突變引發(fā)的疾病發(fā)病相對較晚且具有較高的異質(zhì)性[1-2]。1882年,夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿(PNH)被定義為一種新的疾病,隨后從部分PNH患者的造血干細(xì)胞中鑒定出了PIGA基因突變,PIGA基因編碼的蛋白促進(jìn)糖基磷脂酰肌醇向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn),該基因突變導(dǎo)致補(bǔ)體異常激活并發(fā)生溶血,這也是首次在人體內(nèi)證實(shí)體細(xì)胞突變可以引發(fā)疾病[3-4]。既往研究認(rèn)為體細(xì)胞突變使細(xì)胞發(fā)生惡變傾向,主要與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,研究者們發(fā)現(xiàn)許多非惡性增殖性疾病同樣由體細(xì)胞突變引起[1,6],其中免疫調(diào)節(jié)異常因表現(xiàn)復(fù)雜、機(jī)制多樣而受到特別關(guān)注。本文就體細(xì)胞突變引發(fā)自身炎癥及免疫性疾病的研究進(jìn)展做一綜述。

體細(xì)胞突變的發(fā)生與調(diào)控

受到各種內(nèi)源或外源性因素的影響,遺傳物質(zhì)可以發(fā)生多種變異,包括單堿基突變、短片斷插入缺失突變、拷貝數(shù)變異、轉(zhuǎn)座重組、染色體結(jié)構(gòu)變異及非整倍型改變等,其中以單堿基突變?yōu)樽畛Ｒ姷男问絒7]。人類基因組共有約30億個堿基對,近年研究發(fā)現(xiàn),在人體內(nèi)突變發(fā)生的頻率約為每個細(xì)胞分裂每個堿基對1～5×10-10次[8-9],考慮到人類基因組龐大的堿基數(shù)量及持續(xù)存在的細(xì)胞分裂活動,突變在體細(xì)胞中的產(chǎn)生與累積是普遍存在、時刻發(fā)生的。

體細(xì)胞突變的機(jī)制主要包括DNA復(fù)制錯誤、DNA修復(fù)機(jī)制異常、直接DNA損傷等。DNA復(fù)制錯誤是復(fù)制過程中隨機(jī)發(fā)生的異常事件,包括堿基錯配、染色體錯位、染色質(zhì)斷裂及不規(guī)則鏈合成等(圖1)[10]。當(dāng)DNA復(fù)制錯誤發(fā)生時,細(xì)胞將啟動多種機(jī)制對其進(jìn)行修復(fù)[11],而部分無法進(jìn)行修復(fù)的復(fù)制錯誤,通常將引發(fā)細(xì)胞衰老與凋亡過程,從而阻止變異的累積。例如BRCA1基因編碼的蛋白具有在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)DNA修復(fù)的功能,其突變導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞發(fā)生變異增加[12],端粒酶基因TERT的突變與體細(xì)胞突變引起的克隆性造血存在關(guān)聯(lián)[13]。直接DNA損傷可來源于多種刺激因素,DNA受到刺激發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂、交聯(lián)或堿基修飾,最終未能修復(fù)的損傷經(jīng)由DNA復(fù)制過程產(chǎn)生體細(xì)胞突變[10-11]。

圖1 體細(xì)胞突變發(fā)生的分子機(jī)制[10-11]

體細(xì)胞突變與疾病的關(guān)聯(lián)及意義

由于體細(xì)胞突變發(fā)生的隨機(jī)性,突變細(xì)胞的比例、類型、組織分布均存在個體差異,其臨床表型更為多樣。相較于生殖系致病突變,體細(xì)胞突變的表現(xiàn)可能局限于特定組織,缺乏疾病的某些典型特征,或是癥狀較輕甚至幾乎正常。例如由體細(xì)胞突變引起的Alport綜合征,患者常無癥狀或癥狀不典型, 為明確診斷帶來困難[14-15]。在突變的檢出方面,體細(xì)胞突變的分布及比例不能確定,采用收集血液、唾液或毛囊等較為易行的方式往往難以發(fā)現(xiàn),侵入性檢查的開展困難與對細(xì)胞分群與深度測序的依賴造成了體細(xì)胞突變檢測的難點(diǎn)[16]。另外,特定基因的體細(xì)胞突變已成為腫瘤治療研究熱點(diǎn)。如BRCA1/2基因突變與特定種類惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān),攜帶BRCA1/2突變的腫瘤細(xì)胞缺乏DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制,并展現(xiàn)出對鉑類耐藥等特性。2020年,美國臨床腫瘤協(xié)會(ASCO)在指南中明確提出所有卵巢上皮腫瘤患者應(yīng)當(dāng)接受BRCA1/2及其他易感基因檢測,對于未檢出生殖系突變的,應(yīng)當(dāng)接受腫瘤BRCA1/2體細(xì)胞突變檢測[17]。由此可見,體細(xì)胞突變不僅與疾病表現(xiàn)的異質(zhì)性有關(guān),還將對治療反應(yīng)造成影響。

體細(xì)胞突變與自身炎癥性疾病

自身炎癥性疾病是一種主要由機(jī)體固有免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致的疾病。不同于自身免疫性疾病,自身炎癥以周期性發(fā)熱及系統(tǒng)性炎癥為特征,主要累及髓系細(xì)胞,同時缺乏自身免疫病的多種典型表現(xiàn),如自身抗體產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞異常激活等[18]。單基因自身炎癥病被認(rèn)為是具有明確致病突變的疾病類型,炎癥通路相關(guān)基因發(fā)生突變,使相應(yīng)信號分子的功能喪失或異常激活,進(jìn)而直接引發(fā)疾病表型。而隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的病例提示僅在部分體細(xì)胞中存在的有害突變同樣可以引發(fā)類似表型,單基因自身炎癥病的病因也不再僅限于生殖系突變。

炎癥小體病是由炎癥小體相關(guān)基因發(fā)生功能獲得性突變引發(fā)的自身炎癥性疾病,已報道的致病基因包括NLRP3、NLRP1、NLRC4、MEFV等。NLRP3是炎癥小體的一部分,作為感受器響應(yīng)病原體入侵,激活caspase-1及其下游信號分子。NLRP3功能獲得性突變引發(fā)的疾病表型多樣,統(tǒng)稱為cryopyrin相關(guān)周期性綜合征(CAPS)或新生兒起病的多系統(tǒng)炎癥性疾病(NOMID),此類疾病主要通過顯性遺傳模式或新發(fā)突變致病。2015年,Nakagawa等[19]招募了56例具有CAPS或類似臨床表現(xiàn),但NLRP3基因測序結(jié)果顯示未攜帶已知生殖系致病突變的患者,通過二代測序進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中7例患者(12.5%)存在6個不同的體細(xì)胞突變,均為錯義突變且所占比例不等(5.5%～34.9%)。體外實(shí)驗(yàn)證明新發(fā)現(xiàn)的突變相較野生型均能顯著激活核因子κB(NF-κB)信號通路并增強(qiáng)人單核細(xì)胞株THP-1的細(xì)胞死亡。在具有CAPS臨床表現(xiàn)的患者中,可能有相當(dāng)比例的體細(xì)胞突變攜帶者未能獲得遺傳診斷,提示深度測序的重要性。NLRC4同樣具有識別病原體特定蛋白的功能,激活的NLRC4組成炎癥小體并介導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 (caspase-1)活化,攜帶特定NLRC4生殖系突變的患者存在炎癥小體的過度激活,并以自身炎癥為主要表現(xiàn)[20]。2022年,Wang等[21]首次發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了低比例的NLRC4體細(xì)胞突變可引起晚發(fā)性自身炎癥性疾病。對患者的外周血DNA樣本進(jìn)行測序檢測,發(fā)現(xiàn)其攜帶有很低比例的NLRC4(p.His443Gln)突變,對患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行數(shù)字微滴PCR(ddPCR),結(jié)果顯示單核細(xì)胞具有最高的突變比例(5.69%),中性粒細(xì)胞(2.10%)、B細(xì)胞(2.08%)、T細(xì)胞(0.66%)則相對較低,而在患者毛囊組織與正常人PBMCs中均未發(fā)現(xiàn)該突變。H443Q突變破壞了NLRC4自抑制結(jié)構(gòu),引起持續(xù)的炎癥小體激活,患者血清白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-18及部分炎癥因子水平較正常人升高,PBMCs中炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示在單核細(xì)胞中炎癥激活相關(guān)信號通路存在特別富集,進(jìn)一步提示該突變與疾病的關(guān)聯(lián)。不同于生殖系突變,在體細(xì)胞突變的分析中,除了檢出低頻突變的技術(shù)手段,臨床樣本的合理收集也尤為重要。對于血液細(xì)胞突變,在常規(guī)采集血液的基礎(chǔ)上,有必要進(jìn)行明確的細(xì)胞分群,而對于懷疑其他組織的體細(xì)胞突變,則應(yīng)考慮相應(yīng)部位的采樣。

自身炎癥性疾病一般在新生兒期即迅速起病,而成人起病表現(xiàn)則更為多樣,其中仍有多數(shù)患者缺乏明確的遺傳診斷。2020年的一項(xiàng)研究在表型各異的成人起病的自身炎癥性疾病患者隊(duì)列中,以“基因型主導(dǎo)”的研究策略,通過對外周血進(jìn)行二代測序分析,發(fā)現(xiàn)其中25例攜帶UBA1基因41位甲硫氨酸體細(xì)胞突變。UBA1基因位于X染色體,編碼一種主要的E1酶,具有啟動泛素化修飾的作用。此前研究證明異常泛素修飾與炎癥性疾病發(fā)病存在密切聯(lián)系,目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)個相關(guān)基因,其功能異常可引發(fā)自身炎癥表型。攜帶UBA1體細(xì)胞突變的患者出現(xiàn)成人起病、嚴(yán)重、難治性的全身炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、血細(xì)胞減少、骨髓異常增殖、嗜中性皮膚病、肺部炎癥、軟骨炎、血管炎等,骨髓染色可見髓系細(xì)胞內(nèi)典型空泡形成。對患者各類群細(xì)胞進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)UBA1突變主要見于外周血髓系細(xì)胞,而在淋巴細(xì)胞少見,提示特定細(xì)胞類型與炎癥性疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步通過在細(xì)胞系內(nèi)過表達(dá)UBA1,證實(shí)41位甲硫氨酸突變可以導(dǎo)致UBA1一種亞型不能正常表達(dá),該亞型主要定位于胞質(zhì),從41位甲硫氨酸起始翻譯過程。突變使該亞型缺失起始密碼子,產(chǎn)生從67位甲硫氨酸起始翻譯的截短蛋白,該蛋白不具有正常的酶活性,攜帶突變的細(xì)胞泛素化過程受到抑制,從而激活免疫相關(guān)通路。另外,在斑馬魚模型中敲除UBA1胞質(zhì)亞型將激活系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),證實(shí)UBA1功能異常在炎癥性疾病發(fā)生中的作用。根據(jù)致病突變的遺傳特征以及疾病表型特點(diǎn),研究者將由UBA1體細(xì)胞突變引發(fā)的這一類自身炎癥性疾病命名為液泡性、E1酶相關(guān)、X染色體連鎖、自身炎癥性、體細(xì)胞突變(VEXAS)綜合征[22]。

體細(xì)胞突變與自身免疫性疾病

自身免疫性疾病的特征是針對自身抗原產(chǎn)生病理反應(yīng),導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞損傷或功能紊亂,并引起相應(yīng)臨床表現(xiàn)。自身免疫性疾病常涉及多種細(xì)胞類型,發(fā)生于局部或累及全身多器官[23]。

自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)是一種Fas相關(guān)淋巴細(xì)胞凋亡途徑異常導(dǎo)致的自身免疫性疾病,主要臨床表現(xiàn)包括非惡性淋巴組織增生、肝脾腫大、免疫缺陷、血小板減少等,ALPS常見的致病基因包括FAS、FASLG、CASP10。2004年,Holzelova等[24]首次發(fā)現(xiàn)并報道了發(fā)生于淋巴細(xì)胞中的體細(xì)胞FAS雜合突變可引發(fā)ALPS,攜帶突變的淋巴細(xì)胞不再受到Fas相關(guān)凋亡信號的調(diào)控,而Fas非依賴的調(diào)控機(jī)制不受影響,CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞出現(xiàn)顯著擴(kuò)增,患者表型與既往由生殖系突變引發(fā)的ALPS類似。但體外淋巴細(xì)胞凋亡試驗(yàn)顯示,相比于攜帶生殖系突變的ALPS患者,攜帶FAS體細(xì)胞突變的患者對凋亡刺激響應(yīng)率更高。

RAS家族基因突變在惡性腫瘤中常見,而在2011年,Niemela等[25]與Takagi等[26]分別鑒定了數(shù)例攜帶KRAS基因G13D體細(xì)胞突變的患者,發(fā)現(xiàn)其主要表現(xiàn)為非惡性的白細(xì)胞功能異常與自身免疫。激活的KRAS突變可能通過抑制凋亡相關(guān)蛋白BCL-2作用使T細(xì)胞凋亡減弱,從而引發(fā)自身免疫。因其機(jī)制與ALPS類似但臨床表現(xiàn)不同,作者提出將該種由RAS基因體細(xì)胞激活突變引起的疾病命名為RAS相關(guān)的類ALPS病(RALD)。2016年,Takagi等[27]報道了1例攜帶KRAS基因G13C突變的男性患兒,臨床表現(xiàn)合并免疫性血小板減少、過敏性紫癜以及白塞氏病。突變主要存在于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞中,而未見于粒細(xì)胞,該患者表型與此前報道的RALD存在差異,提示攜帶突變的細(xì)胞類型與疾病表型可能存在關(guān)聯(lián)。

大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)白血病是一種淋巴增生性疾病,主要特征為CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)異常增多、骨髓LGL浸潤、中性粒細(xì)胞減少、常伴發(fā)自身免疫性疾病。LGL白血病本質(zhì)上并不是一種惡性腫瘤,由自身免疫性T淋巴細(xì)胞攻擊自身血液細(xì)胞導(dǎo)致血細(xì)胞減少。STAT3和STAT5B是LGL白血病的常見致病基因,2012的一項(xiàng)研究對76例患者的CTLs進(jìn)行全外顯子測序,發(fā)現(xiàn)其中31例(40%)攜帶STAT3體細(xì)胞突變,且突變均發(fā)生于基因21號外顯子。結(jié)構(gòu)模擬提示這些位點(diǎn)的氨基酸替換影響STAT3與DNA的結(jié)合力,體外實(shí)驗(yàn)同樣證明突變的STAT3可導(dǎo)致受其調(diào)控的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),提示突變可能通過激活CTLs引發(fā)疾病表型[28]。

慢性肉芽腫病(CGD)是一種以反復(fù)發(fā)生危及生命的細(xì)菌及真菌感染和肉芽腫形成為主要特征的免疫異常,其中約5%的患者合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫性血小板減少癥、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。多數(shù)CGD患者攜帶CYBB基因突變,該基因位于X染色體,編碼一種NADPH氧化酶亞基,CYBB表達(dá)異常導(dǎo)致NADPH氧化酶功能喪失,影響吞噬細(xì)胞抵抗病原菌能力,進(jìn)而引發(fā)免疫異常表型。2005年,Wolach等[29]報道了1例女性晚發(fā)性CGD患者,外周血細(xì)胞測序結(jié)果顯示患者攜帶CYBB(p.Tyr30_Arg31delinsTer)突變。檢測mRNA發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞僅表達(dá)突變的mRNA,提示另一條正常的X染色體發(fā)生了隨機(jī)失活,后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)僅0.4%～2%的中性粒細(xì)胞具有正常的NADPH氧化酶活性。另外,對患者頰部細(xì)胞及記憶T細(xì)胞取樣測序未檢出該突變,提示該CYBB基因突變?yōu)榱＜?xì)胞特異性的體細(xì)胞突變。

2017年一項(xiàng)關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的研究發(fā)現(xiàn)患者具有較高的CD8+T細(xì)胞單克隆擴(kuò)增水平,其中約有20%的CD8+T細(xì)胞存在免疫相關(guān)基因體細(xì)胞突變,而在CD4+T細(xì)胞則未檢出同類突變。部分發(fā)生突變的基因,如SLAMF6、IRF1已被證實(shí)與自身免疫相關(guān),提示免疫相關(guān)基因的體細(xì)胞突變在CD8+T細(xì)胞中的累積可能與RA的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)[30]。

Tn綜合征是由于部分血細(xì)胞表面攜帶未完全糖基化的Tn抗原,從而引發(fā)的一種自身免疫性疾病。2005年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)C1GALT1C1基因發(fā)生體細(xì)胞突變是Tn綜合征發(fā)生的重要原因,其編碼的Cosmc蛋白功能缺失將導(dǎo)致Tn抗原的異常糖基化,并產(chǎn)生自身免疫[31]。在IgA腎病中,IgA1分子表面的異常糖基化被認(rèn)為是其分子機(jī)制之一,而Cosmc蛋白則行使IgA1分子半乳糖基化的功能,該基因突變與IgA腎病的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)。

體細(xì)胞突變的檢測

在臨床工作中,不同于生殖系突變導(dǎo)致的遺傳性疾病,體細(xì)胞突變?nèi)狈γ鞔_的家系遺傳模式,其導(dǎo)致的疾病常無家族史可循,為遺傳診斷帶來一定困難。近年來,隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展與普及,全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)、全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)、靶區(qū)域測序(target sequencing)、單細(xì)胞全基因組測序等技術(shù)的應(yīng)用大大推動了體細(xì)胞突變相關(guān)研究。而在實(shí)際工作中,對于可疑患有遺傳性疾病的患者組織樣本,WES與WGS以其簡便的樣本采集,成熟的分析流程與較低的價格成為目前遺傳診斷主流的技術(shù)方法。體細(xì)胞突變的檢測流程主要包括(1)測序與比對。測序得到的原始序列經(jīng)過質(zhì)控,將可信的序列片段匹配到已知正常人類基因組序列的對應(yīng)位置,在匹配序列中可能包含部分位置的錯配。(2)突變檢測。匹配到基因組的序列片段經(jīng)過去重復(fù),得到基因組各區(qū)域的覆蓋深度,同時借助基因或功能區(qū)域在基因組中的已知位置完成突變的識別。對于生殖系雜合突變,正常序列與突變序列比例大約為1∶1,而對于體細(xì)胞突變,突變序列的比例往往顯著低于正常序列,甚至在一些覆蓋深度較低的區(qū)域,體細(xì)胞突變可能無法檢出。另外,由于需要鑒別由測序質(zhì)量不佳帶來的假陽性,有必要在后續(xù)分析中應(yīng)用一代測序、PCR等低通量手段或深度更高的靶區(qū)域測序進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。(3)突變注釋與解讀。檢測得到的突變條目僅包含本身位置與質(zhì)量信息,為了解突變的性質(zhì),需要借助多個數(shù)據(jù)庫,對該突變的致病性軟件評分、人群頻率、既往研究情況等各方面進(jìn)行注釋。在突變解讀方面,除臨床醫(yī)生的個人判斷外,美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)制訂了關(guān)于孟德爾遺傳病變異解讀標(biāo)準(zhǔn)與指南,對突變通過多種證據(jù)進(jìn)行綜合評價,得到可供參考的突變致病性分級[32]。

小結(jié)：體細(xì)胞突變可能發(fā)生于個體生命周期的各個階段,并具有隨機(jī)性,可發(fā)生于多種細(xì)胞,即使攜帶同一基因突變的患者,在發(fā)病時間、臨床表現(xiàn)等方面也具有很大差異。與生殖系突變的直接對應(yīng)關(guān)系不同,體細(xì)胞突變發(fā)生的時間、細(xì)胞微環(huán)境、突變比例均可能影響疾病的表型。對于體細(xì)胞突變的發(fā)現(xiàn)及致病機(jī)制研究有助于更好地從分子、細(xì)胞層面認(rèn)識特定疾病。體細(xì)胞突變在自身炎癥與自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用(表1)。對體細(xì)胞突變的研究極大地豐富了對基因變異與疾病之間的認(rèn)識,對于疾病的精準(zhǔn)診斷、分型、治療具有重要意義。

表1 體細(xì)胞疾病引發(fā)的自身炎癥及免疫性疾病