張秀麗，武 曦 綜述， 李昀生 審校

(1.北京聯(lián)合大學(xué)門診部口腔科,北京 100101;2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科,重慶 400037;3.應(yīng)急總醫(yī)院口腔科,北京 100028)

牙周炎是1種慢性感染性疾病，是由于菌斑生物膜導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而導(dǎo)致牙齒支持組織的破壞，最終造成牙齒的松動和脫落，是牙喪失的重要原因[1]。再生性治療是牙周炎治療的重要手段之一，其目的是重建因牙周炎破壞的牙周組織的解剖結(jié)構(gòu)及功能，包括牙槽骨、牙周膜及牙骨質(zhì)[2]。然而，牙周組織的再生一直被認(rèn)為極富挑戰(zhàn)性，其中干細(xì)胞由于具有多向分化及自我復(fù)制的能力，被認(rèn)為是1種有效的再生治療手段，具有廣泛的臨床前景[3]。 細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)囊泡，干細(xì)胞分泌的EVs可表現(xiàn)出與干細(xì)胞相近的功能，如促進(jìn)組織修復(fù)及再生等[4]。利用干細(xì)胞源性EVs治療可以規(guī)避干細(xì)胞移植的風(fēng)險，提供無細(xì)胞再生的方法，近年來成為再生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5]。本文對干細(xì)胞源性EVs在牙周再生中的研究進(jìn)展及應(yīng)用作一綜述。

1 EVs的生物學(xué)特性

1.1 EVs的生物起源

根據(jù)EVs的生物發(fā)生機(jī)制及生物生理學(xué)特性，EVs可分為3類：外泌體(exosomes)、微囊泡(microvesicles)及凋亡小體(apoptotic bodies)。外泌體的直徑大小為30～120 nm，其形成是通過細(xì)胞膜內(nèi)吞，與早期內(nèi)體(early endosomes)融合，內(nèi)陷形成多囊泡體(multivesicular bodies,MVBs)。MVBs與細(xì)胞膜上特定的部位融合，形成芽泡，以外泌的方式釋放[6]。在細(xì)胞膜內(nèi)吞融合過程中，細(xì)胞質(zhì)中的成分會通過內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)分選到MVBs內(nèi)的管腔內(nèi)囊泡(intrlunimal vesicles,ILVs)中[7]。

與外泌體不同，微囊泡是1組直接源于細(xì)胞膜的非凋亡細(xì)胞外囊泡，直徑大小為50～1 000 nm。當(dāng)細(xì)胞激活信號引起細(xì)胞質(zhì)的Ca2+水平增高，導(dǎo)致脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的變化，翻轉(zhuǎn)酶的失活及轉(zhuǎn)出酶的活化，細(xì)胞膜出泡，形成微囊泡，釋放到細(xì)胞外[8]。

細(xì)胞在凋亡過程中會釋放一類細(xì)胞外囊泡，稱為凋亡小體。凋亡小體的直徑范圍較大，在50～2 000 nm，其形成是細(xì)胞膜向外出泡，并包含部分細(xì)胞膜片段[9]。

1.2 EVs的組成

EVs的組成成分會根據(jù)細(xì)胞來源有所不同，總體而言，EVs普遍包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種生物活性物質(zhì)[10]。EVs的蛋白成分主要包括質(zhì)膜蛋白及與其形成相關(guān)的蛋白，如ESCRT和膜運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白。外泌體含較多跨膜蛋白及多泡小體形成相關(guān)蛋白，而微囊泡富含整合蛋白、選擇蛋白及CD40配體[11]。EVs中包含大量核酸，包括DNA、微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)，可以表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能。EVs脂質(zhì)成分包括鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰絲氨酸及神經(jīng)酰胺，存在于其脂質(zhì)雙分子層膜中，而EVs內(nèi)部也包含膽固醇、類花生酸脂肪酸等生物活性脂質(zhì)[12]。

1.3 干細(xì)胞源性EVs的生物學(xué)功能

干細(xì)胞源性EVs可通過旁分泌途徑發(fā)揮干細(xì)胞的治療作用[4]，包括：(1)組織損傷中起到保護(hù)作用；(2)免疫調(diào)節(jié)作用；(3)促進(jìn)血管形成、細(xì)胞分化及抑制細(xì)胞凋亡的作用。干細(xì)胞源性EVs在幾種損傷類型的疾病中顯示出了可期望的治療前景。RANGHINO等[13]在急性腎損傷的大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞源性EVs可以通過激活腎小管上皮細(xì)胞增殖而減輕腎損傷及改善腎功能。在急性肝損傷動物模型研究中，TAN等[14]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞源性外泌體可以引起增殖蛋白的高表達(dá)并抑制肝細(xì)胞凋亡，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。干細(xì)胞源性EVs亦可緩解動物模型的心肌損傷。MAO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EVs中的miRNA224-5p可以起到對抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。干細(xì)胞源性EVs具有免疫活性，包含趨化分子及細(xì)胞因子可以調(diào)控免疫細(xì)胞。這些細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、干細(xì)胞生長因子(HGF)、吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1(IDO-1)及白細(xì)胞介素-10等，可以通過信號通路調(diào)控自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞[16]。干細(xì)胞源性EVs還有促進(jìn)血管生成的功能。有研究發(fā)現(xiàn)，在支氣管肺發(fā)育不良的大鼠模型中，干細(xì)胞源性EVs可以對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，從而改善模型動物的肺泡化及血管生成[17]。

2 干細(xì)胞源性EVs在牙周再生中的應(yīng)用

2.1 干細(xì)胞源性EVs治療的優(yōu)勢

在當(dāng)前的牙周再生性手術(shù)中，往往采用合成或天然的生物材料用以修復(fù)牙周支持組織的結(jié)構(gòu)及功能，但這些治療手段尚不能獲得可靠而完全的牙周再生。因此，干細(xì)胞源性EVs基于組織工程學(xué)及干細(xì)胞的再生療法作為新療法逐漸嶄露頭角[18]。干細(xì)胞由于具備自我更新、多向分化及免疫調(diào)節(jié)的功能，被許多學(xué)者應(yīng)用于牙周再生的研究中。在動物實(shí)驗中，自體或異體的干細(xì)胞增殖后，附于各種支架材料上，移植于動物的牙周缺損組織中，可以成功地重建出牙槽骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周韌帶樣組織[19]。然而，直接的干細(xì)胞療法卻存在許多問題。首先，移植的干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后，會大量死亡，最終發(fā)揮細(xì)胞替代再生作用的數(shù)目有限。其次，體內(nèi)干細(xì)胞移植治療也存在致瘤風(fēng)險，細(xì)胞生長及分化不可控，以及可能的免疫原性[20]。有研究顯示，干細(xì)胞源性EVs的介質(zhì)可以復(fù)制干細(xì)胞的治療效果，提示在干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生中，旁分泌因子起到重要作用[21]。干細(xì)胞源性EVs還具備其他的諸多優(yōu)勢。首先，干細(xì)胞源性EVs不表達(dá)細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合體(MHC)，因此，免疫原性更低；其次，與干細(xì)胞需要培養(yǎng)、難于貯存不同，EVs易于存儲，可長期保存并保持活性[22]。綜合這些優(yōu)點(diǎn)，干細(xì)胞源性EVs凸顯了巨大的治療潛力，為組織再生提供了無細(xì)胞治療的全新前景。

2.2 干細(xì)胞源性EVs在牙周再生中的應(yīng)用

牙周炎的臨床特征就是牙周支持組織的破壞，其中包括牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)及牙齦，因此，牙周組織再生包括牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)的再生。干細(xì)胞源性EVs在牙周再生方面的研究主要集中于體外實(shí)驗和動物實(shí)驗。

在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)分泌的EVs與牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PLSCs)共同培養(yǎng)的研究中，結(jié)果顯示BMMSCs分泌的外泌體可以促進(jìn)PLSCs的體外增殖和成骨分化能力[23]。ZHANG等[24]的研究中將人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs與BMMSCs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)EVs為BMMSCs所吸收，隨之BMMSCs發(fā)生增殖和成骨分化。當(dāng)介質(zhì)中加入磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑時，成骨過程受到抑制。說明EVs誘導(dǎo)的BMMSCs增殖和成骨分化部分是通過PI3K/AKt通路所激活的。而牙周再生的主要目的之一就是因牙周炎破壞的牙槽骨的再生。GANGADARAN等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在體外，人脂肪干細(xì)胞來源的EVs可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，而且可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成，而在小鼠體內(nèi)實(shí)驗中，EVs可以促進(jìn)血管形成，而血管形成是牙周組織再生所必須的生理學(xué)基礎(chǔ)。

干細(xì)胞源性EVs在牙周再生的體內(nèi)研究多選擇不同干細(xì)胞來源的EVs或包含EVs的條件培養(yǎng)液(conditioned medium，CM)，應(yīng)用各種給藥方式在動物模型上進(jìn)行研究。MOHAMMED等[26]采用結(jié)扎建立大鼠牙周炎模型，將脂肪干細(xì)胞來源的EVs注射到缺損區(qū)，結(jié)果獲得排列有序的類似牙周膜韌帶的組織再生，治療效果優(yōu)于采用脂肪干細(xì)胞本身的治療效果。CHEW等[27]用膠原海綿作為人干細(xì)胞源性EVs的載體，用于外科所致大鼠牙周骨內(nèi)缺損的再生治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有新生骨及牙周韌帶的牙周組織再生。該研究發(fā)現(xiàn)，EVs是通過CD73介導(dǎo)的腺苷受體激活蛋白激酶B及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路來促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的遷移及增殖。QIU等[28]用手術(shù)造成大鼠的牙周組織缺損，用可吸收膠原膜作為載體，結(jié)合牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)來源的EVs進(jìn)行治療，結(jié)果獲得明顯的牙周組織再生。其機(jī)制可能包括PDLSCs、GMSCs來源EVs對牙炎癥因子的調(diào)控及促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的成骨分化。另一研究選擇牙周炎大鼠模型，用水溶膠作為載體，將BMMSCs源性EVs注入牙周病變區(qū)。結(jié)果顯示BMMSCs源性EVs可以促進(jìn)牙周組織的再生，其部分原因可能為EVs介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK信號通路以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能，以及影響巨噬細(xì)胞聚集和TGF-β1 表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)[29]。類似的實(shí)驗研究也發(fā)現(xiàn)，脂多糖預(yù)處理過的牙囊細(xì)胞來源的EVs可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，并且將載有牙囊細(xì)胞來源的EVs的水溶膠注射到牙周炎大鼠模型的牙周袋中，可以促進(jìn)牙周組織的再生[30]。

綜上所述，無論干細(xì)胞的選擇還是載體的選擇，動物模型研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞源性EVs可以為牙周組織再生提供有效的更為安全的新無細(xì)胞療法。但EVs應(yīng)用于牙周再生目前尚無人體研究，真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐，尚需進(jìn)一步的基礎(chǔ)及設(shè)計良好的臨床試驗加以驗證。