呂麗娜，楊燦華

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院血液內(nèi)科，廣西 南寧 530199）

地中海貧血（thalassemia）又稱珠蛋白生成障礙性貧血，是臨床常見(jiàn)的遺傳性血紅蛋白病，其發(fā)病機(jī)制與調(diào)控珠蛋白合成的基因缺失或突變有關(guān)，可引起血紅蛋白α 鏈及β 鏈珠蛋白合成比例的失衡，導(dǎo)致紅細(xì)胞壽命縮短，促使溶血性貧血的形成[1]。近年來(lái)，該疾病的診斷及臨床治療方面取得了不小進(jìn)展，但仍是全球分布最為廣泛的遺傳學(xué)疾病之一，多伴有脾臟腫大、骨骼畸形、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、鐵過(guò)載以及心臟疾病等問(wèn)題，對(duì)其身體健康造成了嚴(yán)重影響[2]?；诖?，該病的診治方案及研究進(jìn)展獲得了臨床的廣泛關(guān)注，現(xiàn)本文對(duì)地中海貧血診療現(xiàn)狀及分子生物學(xué)研究綜述如下，以期為該病的臨床研究提供相應(yīng)的參考信息。

1 地中海貧血的診療現(xiàn)狀

1.1 診斷 現(xiàn)階段，基因診斷是地中海貧血最為準(zhǔn)確的診斷方式，對(duì)于該病的早期檢查具有較高的可靠性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前檢查中[3]。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)院多以實(shí)驗(yàn)室血細(xì)胞檢查作為地中海貧血的首選篩查方式，首先對(duì)小細(xì)胞低色素性貧血進(jìn)行初步診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)：血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）以及平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）降低；隨后進(jìn)行血紅蛋白分析，HbF、HbA2 增多，或血紅蛋白電泳出現(xiàn)其他異常血紅蛋白；最后，在發(fā)現(xiàn)明確珠蛋白變異情況下再行基因診斷[4]。

1.2 治療 目前，地中海貧血的常用治療方式包括輸血治療、去鐵治療、造血干細(xì)胞移植、脾切除術(shù)、基因治療等。國(guó)際地中海貧血聯(lián)盟（TIF）指南指出，適當(dāng)?shù)囊?guī)范性輸血計(jì)劃是治療地中海貧血的常規(guī)方式，但需明確其輸血時(shí)間、血紅蛋白最佳標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)去鐵治療的影響，以及輸血反應(yīng)等問(wèn)題[5]。我國(guó)則主要參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組的地中海貧血診斷與治療指南，以長(zhǎng)期規(guī)范性輸血治療為主，在人類白細(xì)胞抗原（HLA）相合的情況下，首選造血干細(xì)胞移植治療；當(dāng)輸血次數(shù)超過(guò)10～20 次、血清鐵蛋白＞1000 μg/L 時(shí)考慮開(kāi)展去鐵治療；對(duì)于12 歲以下患兒盡量不采用脾切除術(shù)治療[6]。此外，基因活化治療是當(dāng)前的重要研究方向，應(yīng)用化學(xué)藥物可改善β 地中海貧血的臨床癥狀，但目前仍然在研究中?？傊斞?lián)合鐵螯合劑去鐵仍是地貧患者最主要的治療方法。

2 地中海貧血的分子生物學(xué)研究

2.1 疾病分子生物學(xué)研究 地中海貧血是由于調(diào)控珠蛋白合成的基因缺失或突變引起的溶血性貧血，根據(jù)基因分型，可分為α、β、δβ、δ 地中海貧血等，以前兩者最為高發(fā)。α-地中海貧血主要是由于α-珠蛋白基因的大片段缺失所導(dǎo)致，其缺失型包括--SEA、-α3.7、-α4.2，少數(shù)是由小片段堿基插入、缺失或點(diǎn)突變所致，屬于包括非缺失型，包括αWS、αCS、αQS[7]。β-地中海貧血?jiǎng)t主要是由于11（p15.5）染色體上β 珠蛋白基因點(diǎn)突變所致，少數(shù)是由β-珠蛋白基因缺失引起，按照珠蛋白鏈的缺失程度可分為β+（輕型突變）與β0（重型突變），其癥狀表現(xiàn)也有所差異[8]。

2.2 分子生物學(xué)診斷及應(yīng)用

2.2.1 Southern 印記雜交 Southern 印記雜交是DNA圖譜的重要分析方式，該技術(shù)可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法分離限制性內(nèi)切酶，隨后完整轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜上相應(yīng)位置，與放射性同位素標(biāo)記的DNA 進(jìn)行探針雜交，隨后通過(guò)放射性自顯影確定雜交片斷的大小與位置，是當(dāng)前檢測(cè)α-珠蛋白基因缺陷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。但Southern 印記雜交操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)所用基因組DNA 質(zhì)量具有較大依賴性，且需用到放射性同位素，不適用于臨床的常規(guī)診斷。

2.2.2 缺口聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（gap-PCR）缺口PCR 常用于缺失型突變的檢測(cè)，該技術(shù)可針對(duì)缺失區(qū)域上下游序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)引物，正常情況下，引物距離較遠(yuǎn)無(wú)法擴(kuò)增出特異片段，當(dāng)上下游序列發(fā)生缺失突變時(shí)，引物之間的距離因斷端連接而靠近，由此可擴(kuò)增出特定長(zhǎng)度的片段，后續(xù)可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳所得片段，檢測(cè)其樣品的基因型。基于此，運(yùn)用單管多重PCR 技術(shù)在同一體系中加入多對(duì)互補(bǔ)引物，可檢測(cè)出多種序列缺失型突變，包括-SEA、-THAI、-α4.2等。鄧宇運(yùn)等[10]對(duì)缺口PCR 在地中海貧血中的診斷價(jià)值進(jìn)行了探究，其結(jié)果顯示，缺口PCR 對(duì)α-地中海貧血具有較高的診斷準(zhǔn)確率、靈敏度及特異度，且操作簡(jiǎn)單、快速，適用于缺失型α-地中海貧血的分子篩查及基因診斷中。

2.2.3 等位基因特異性寡核苷酸探針點(diǎn)雜交（ASO）ASO 僅適用于已知基因突變的檢測(cè)，其探針為20 bp左右長(zhǎng)度的核苷酸，共包括2 種，一種與正?；蛐蛄幸恢拢瑑H可與正?；蛐蛄须s交；另一種則與突變基因序列一致，僅可與突變基因序列雜交，由此區(qū)分堿基突變的基因。該技術(shù)可與PCR 結(jié)合，在突變點(diǎn)基因片段的體外擴(kuò)增基礎(chǔ)上，應(yīng)用ASO 探針作點(diǎn)雜交，具有較高的靈敏度與精確度，但單次雜交僅可檢測(cè)一種突變，且對(duì)DNA 數(shù)量及純度具有較高要求[11]。

2.2.4 反向點(diǎn)雜交（RDB）RDB 的檢測(cè)機(jī)制與ASO的原理基本相同，不同之處在于固定靶DNA 被膜上固定探針?biāo)娲枚喾N特異性探針中膜條與擴(kuò)增靶序列的雜交，增加單次雜交可檢測(cè)的突變類型，改變了傳統(tǒng)雜交法僅可檢測(cè)一種突變的操作模式。該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低，在基層實(shí)驗(yàn)室的基因篩查及診斷中也具有較高的適用性。肖奇志等[12]對(duì)不同原理PCR 法在地中海貧血產(chǎn)前診斷中的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，其結(jié)果顯示，單管多重PCR 法聯(lián)合RDB 的檢測(cè)靈敏度較高，可準(zhǔn)確檢出常見(jiàn)非缺失α-地中海貧血突變類型；同時(shí)還可對(duì)單管多重PCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在地貧產(chǎn)前診斷中具有較高的可行性，且可作為質(zhì)量控制的替代方式，用以保證產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，值得臨床遺傳診斷實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

2.2.5 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）MLPA 技術(shù)是在多重?cái)U(kuò)增探針雜交（MAPH）基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)，該方式可通過(guò)與樣本DNA 雜交，被連接酶連接的探針進(jìn)行擴(kuò)增，隨后依據(jù)其靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物量進(jìn)行定量分析，是針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的新技術(shù)，可檢出目的序列內(nèi)的全部基因缺陷[13]。但MLPA 操作相對(duì)繁瑣，且檢驗(yàn)條件要求高，不適用于大規(guī)模檢測(cè)，可作為當(dāng)前地貧基因缺失檢測(cè)的補(bǔ)充方式。

2.2.6 基因芯片法 基因芯片法是20 世紀(jì)90 年代中期以來(lái)影響最為深遠(yuǎn)的科研進(jìn)展之一，該技術(shù)是利用2 種不同熒光染料標(biāo)記的靶序列與同一基因芯片進(jìn)行雜交，通過(guò)不同顏色的熒光信號(hào)強(qiáng)度反映出基因表達(dá)的變化[14]。此外，基因芯片法可將大量探針同時(shí)固定于支持物上，因此可一次性檢測(cè)大量生物分子，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方式檢測(cè)項(xiàng)目單一、低通量、費(fèi)用昂貴等弊端，具有敏感、高效、平行化及自動(dòng)化等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

2.2.7 DNA 測(cè)序技術(shù) DNA 測(cè)序是基因分析的最精確方式，現(xiàn)已成為分析點(diǎn)突變的金標(biāo)準(zhǔn)。第一代DNA 測(cè)序技術(shù)由最初的化學(xué)降解法發(fā)展至熒光自動(dòng)測(cè)序，開(kāi)啟了DNA 測(cè)序的自動(dòng)化時(shí)代。而第二代測(cè)序技術(shù)在以上基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)序，可一次性對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)條DNA 進(jìn)行序列測(cè)序，不僅高效、精確，還可檢測(cè)出新型突變類型[15]。目前，第三代測(cè)序技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，其測(cè)序平臺(tái)主要包括Helicos Biosciences 公司的tSMSTM（truesinglemolecular sequencing）平臺(tái)及美國(guó)Pacific Bioscies 公司的SMRT（single molecule real time）平臺(tái)等?，F(xiàn)隨著國(guó)內(nèi)科研實(shí)力及經(jīng)濟(jì)實(shí)力的快速提升，DNA 測(cè)序也由科研向醫(yī)療檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)行轉(zhuǎn)變，對(duì)α 及β 地中海貧血基因突變的診斷具有重要意義。

2.2.8 其他 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RQ-PCR）、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析（PCR-RFLP）、擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng)（ARMS）、單鏈構(gòu)向多態(tài)性PCR（PCR-SSCP）以及變性梯度凝膠電泳（DGGE）等均是地中海貧血突變基因的常用檢測(cè)方式，其應(yīng)用價(jià)值各異，臨床需基于其可行性選擇應(yīng)用。

2.3 分子生物學(xué)治療及應(yīng)用

2.3.1 減少無(wú)效紅細(xì)胞生成 無(wú)效紅細(xì)胞生成是地中海貧血的重要病理生理機(jī)制，多與珠蛋白基因片段缺失或珠蛋白合成肽鏈?zhǔn)Ш獾仍蛴嘘P(guān)。珠蛋白基因表達(dá)受限可引起珠蛋白肽鏈過(guò)剩，進(jìn)而無(wú)法形成穩(wěn)定的血紅蛋白四聚體，易導(dǎo)致氧化沉淀形成的包涵體沉積于紅細(xì)胞膜上，致使紅細(xì)胞變形能力下降，紅細(xì)胞壽命縮短，引起大量無(wú)效紅細(xì)胞生成，最終導(dǎo)致溶血性貧血的發(fā)生。因此，減少無(wú)效紅細(xì)胞生成是地中海貧血的重要治療方式。①重組人促紅細(xì)胞生成素（rHuEPO）：促紅細(xì)胞生成素（EPO）是腎臟缺氧時(shí)釋放的糖蛋白激素，可刺激骨髓中紅系祖細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，同時(shí)防止其凋亡。研究證實(shí)[16，17]，rHuEPO 可刺激血紅蛋白F（HbF）的合成，以此增強(qiáng)紅細(xì)胞生成，現(xiàn)已被視為地中海貧血病例輸血治療的安全替代方式，在脾切除以及初始HbF＞40%或低EPO 患者中可發(fā)揮重要作用，但對(duì)于嚴(yán)重的地中海貧血患者，尚需大規(guī)模的臨床試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估與驗(yàn)證；②JAK2 抑制劑：抑制JAK2/STAT5 途徑對(duì)EPO 過(guò)度刺激的負(fù)面影響一直是治療地中海貧血的重要研究方向，其中JAK2 是EPO 的唯一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物，可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活因子以及平行信號(hào)通路的激活，促使紅系祖細(xì)胞的增殖與分化。基于此，JAK2抑制藥物的應(yīng)用將有利于地中海貧血患者的治療。據(jù)相關(guān)研究顯示[18]，JAK2 抑制劑可有效改善無(wú)效紅細(xì)胞的生成，同時(shí)逆轉(zhuǎn)脾腫大。目前，魯索利替尼是美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的首批JAK2 抑制劑藥之一，該藥物的應(yīng)用有助于減輕重型地中海貧血患者的輸血負(fù)擔(dān)，緩解其脾腫大及無(wú)效紅細(xì)胞生成等狀況，但其安全性及耐受性尚在研究中[19]；③激活素抑制劑：激活素抑制劑可影響紅細(xì)胞生成晚期，對(duì)于無(wú)效紅細(xì)胞生成引起的貧血疾病中具有一定治療作用。目前，臨床針對(duì)激活素受體-Ⅱ（ActRIIB 或ActRIIA）開(kāi)發(fā)了2 種藥物，即Luspatercept（羅特西普）與Sotatercept（索特西普），此2 種藥物均是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β)家族配體的重組化合物，可作為激活素ⅡA型與ⅡB型的修飾受體，與人免疫球蛋白IgG1-Fc 片段融合，進(jìn)而減輕下游信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用，用于無(wú)效紅細(xì)胞相關(guān)病癥的治療。相關(guān)研究指出[20]，該藥對(duì)貧血的改善效果好，且耐受性良好，可減少患者的輸血負(fù)荷，但針對(duì)患者可接受的活性劑量還需在后續(xù)研究的進(jìn)一步觀察；④Foxo3 誘導(dǎo)劑：Foxo3 可于紅細(xì)胞生成的早期階段上調(diào)抗氧化酶，以此保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害，在減少無(wú)效紅細(xì)胞生成的過(guò)程中具有重要作用。同時(shí)，F(xiàn)oxo3 的激活可促進(jìn)紅細(xì)胞成熟，誘導(dǎo)HbF 的紅細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而緩解貧血狀況，因此，F(xiàn)oxo3 誘導(dǎo)劑的應(yīng)用可有效改善地中海貧血的病情進(jìn)展。二甲雙胍作為二型糖尿病的常用治療藥物，同時(shí)可作為Foxo3 誘導(dǎo)劑，激活Foxo3 促進(jìn)HbF 的紅細(xì)胞表達(dá)，有利于貧血癥狀的減輕[21]。Camaschella C 等[22]對(duì)二甲雙胍在鐮狀細(xì)胞性貧血及非依賴性輸血地中海貧血中的治療作用進(jìn)行了研究試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，二甲雙胍可增加紅細(xì)胞祖細(xì)胞中Foxo3 的活性，對(duì)HbF 的紅細(xì)胞表達(dá)具有積極的改善作用。但以上試驗(yàn)尚處于臨床前研究階段，其應(yīng)用有效性及安全性待進(jìn)一步評(píng)估觀察。

2.3.2 鐵螯合劑 自發(fā)性溶血及頻繁的輸血均可導(dǎo)致鐵元素在體內(nèi)的過(guò)量沉積，進(jìn)而引起心臟、肝臟以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害。因此，針對(duì)鐵過(guò)載進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)治療，是減輕其疾病損害的重要方式[23，24]，現(xiàn)多以鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)分子的調(diào)控為主要研究方向。①鐵調(diào)素：鐵調(diào)素是體內(nèi)鐵代謝調(diào)節(jié)的重要激素，其生物活性形式是由25 個(gè)小分子氨基酸多肽組成，可通過(guò)血液循環(huán)發(fā)揮作用，但無(wú)效紅細(xì)胞生成及組織缺氧可抑制鐵調(diào)素的合成與分泌，導(dǎo)致其體內(nèi)循環(huán)降低，引起鐵儲(chǔ)存過(guò)多造成鐵過(guò)載。因此，調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵調(diào)素水平是減少地中海貧血鐵超負(fù)荷的重要方向[25]。Casu C 等[26]研究指出，Mini-hepcidins等微量鐵調(diào)素的使用可顯著改善小鼠無(wú)效紅細(xì)胞生成、鐵超負(fù)荷及貧血狀態(tài)，具有確切的治療效果。Aghajan M 等[27]的研究顯示，抑制TMPRSS6 基因可減輕其對(duì)內(nèi)源性鐵調(diào)素合成的干擾，改善貧血并減少鐵負(fù)荷，逆轉(zhuǎn)脾腫大，對(duì)非輸血依賴性地中海貧血具有積極的治療作用；②腸道缺氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF2alpha）：鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將鐵從腸細(xì)胞轉(zhuǎn)入血液循環(huán)，而HIF2alpha 則是調(diào)節(jié)該過(guò)程的關(guān)鍵因子，對(duì)血液中鐵含量的調(diào)節(jié)具有重要作用。Anderson ER等[28]研究指出，在地中海貧血小鼠模型中，HIF2alpha 可于發(fā)病早期被激活，由此可引起鐵積累，因此，破壞HIF2alpha 信號(hào)是糾正地中海貧血鐵超負(fù)荷的重要研究方向，現(xiàn)已成為該病治療的研究熱點(diǎn)之一。

2.3.3 基因治療 依據(jù)其分子機(jī)制，地中海貧血的基因治療可通過(guò)珠蛋白基因的修復(fù)或重新激活，誘導(dǎo)HbF 增加，以此促進(jìn)珠蛋白肽鏈比例的平衡，改善紅細(xì)胞生成，達(dá)到治療目的[29]。其中應(yīng)用自體干細(xì)胞的基因治療可作為造血干細(xì)胞移植的改良形式，將造血干細(xì)胞與祖細(xì)胞分離后，利用慢病毒載體將外源性珠蛋白基因整合至宿主細(xì)胞基因組中，隨后將修飾細(xì)胞重新填充造血，以此糾正蛋白肽鏈比例，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成。此外，還有依賴于靶向基因編輯的替代方式，通過(guò)人造血干細(xì)胞相關(guān)珠蛋白基因的編輯，促使其分化為成熟紅細(xì)胞，以此調(diào)節(jié)肽鏈中的珠蛋白平衡，改善病理狀況[30]。但造血干細(xì)胞存在核酸酶，其靶向基因傳遞方式在臨床的適用性較為有限，同時(shí)，在應(yīng)用基因編輯治療時(shí)，需充分明確靶核酸酶的遺傳毒性，以此不斷改進(jìn)并完善，用于地中海貧血的治療[31]。

3 總結(jié)

近年來(lái)，地中海貧血的診治研究取得了巨大進(jìn)步，其疾病診斷多以實(shí)驗(yàn)室血細(xì)胞檢查及基因診斷為主，而治療方案則主要為輸血治療、去鐵治療、造血干細(xì)胞移植以及脾切除等方式。在此基礎(chǔ)上，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為該病的診斷與治療帶來(lái)了新的研究方向，隨著多種分子生物學(xué)診治方式的相繼出現(xiàn)，部分藥理學(xué)或遺傳學(xué)的新治療靶點(diǎn)也逐漸被證實(shí)，但其應(yīng)用大多處于研究狀態(tài)，發(fā)展?jié)摿ι杏写鞔_，臨床需在此基礎(chǔ)上不斷完善，以促進(jìn)該病診療技術(shù)的不斷提升。