宋宏新，劉曉鳳，程妮，薛海燕

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021；2.深圳普門科技股份有限公司，深圳 518108）

0 引言

牛乳和羊乳是世界產(chǎn)量最大的兩類乳源[1]，對其成分與功能的研究歷來沒有間斷，兩者的差異造成了消費者選擇上的困擾。蛋白質(zhì)是乳中重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，其含量大、種類多，是牛羊乳區(qū)別檢測的主要目標物質(zhì)[2]。羊乳還包括綿羊乳與山羊乳兩大類，兩者蛋白質(zhì)組成亦存在差異，國內(nèi)羊乳以山羊乳為主，因此本文以山羊乳（文中羊乳皆指山羊乳）為研究對象，與牛乳的蛋白質(zhì)組進行了比較研究。

利用蛋白質(zhì)組學（proteomics）方法可對組織或系統(tǒng)的全部蛋白的表達模式與功能模式進行研究[3]，等電聚焦(IEF)和SDS-PAGE結(jié)合的雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)[4-5]是最常用的蛋白組分析技術(shù)，該技術(shù)廣泛應用到了生物學及食品等研究領(lǐng)域[6-9]。已有報道利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)來鑒定乳中蛋白種類、蛋白含量并對蛋白質(zhì)功能進行分析等[10]。Lee[11]等使用2-DE圖譜結(jié)合MALDITOF MS技術(shù)對牛初乳進行蛋白質(zhì)組分析，鑒定出了白蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白前體、胰蛋白酶抑制劑等已知的蛋白，此外還鑒定了許多未知的乳清蛋白。Yang[12]等使用2-DE技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜法來檢測牛乳中植物蛋白摻假，根據(jù)摻假牛乳凝膠上特有的蛋白質(zhì)斑點可知，在摻雜大豆蛋白的牛乳中檢測到β-大豆球蛋白和大豆球蛋白，而在摻雜豌豆蛋白的牛乳中檢測到豌豆球蛋白，在摻雜小麥蛋白的牛乳中檢測到β淀粉酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑。陳靜廷[13]等利用2-DE技術(shù)分析pH 4.6與pH 4.8沉淀酪蛋白后的牛乳清樣品，結(jié)果顯示pH 4.6時提取的乳清樣品2-DE圖譜中存在124個蛋白點，pH 4.8時有127個蛋白點，結(jié)合圖譜清晰度及蛋白點分離效果可得pH 4.6酪蛋白沉淀提取法更適用于牛乳清樣品的制備。雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)組結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可以較好的分離蛋白并對其種類進行鑒定，本研究便基于該技術(shù)對鮮牛羊乳中的蛋白質(zhì)組進行全面系統(tǒng)的比較，并探討牛羊乳的潛在生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

鮮牛乳與鮮羊乳分別由陜西西安草灘奶牛場與金牛乳業(yè)有限公司提供，乳樣采集后密封，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPs，昂飛公司；碘乙酰胺IAA、硫脲，美國Amersham公司；PMSF（蛋白酶抑制劑）、DTT（二硫蘇糖醇），美國Amresco公司；固相pH梯度干膠條(pH4～7,24 cm)、IPG緩沖液(pH4～7)，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；胰酶，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；HCCA(基質(zhì))，美國應用生物系統(tǒng)公司；中分子量標準蛋白質(zhì)、牛血清標準品BSA，美國Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GE Ettan IPGphor 3等 電 聚 焦 儀、GE Ettan DALTsix雙向電泳系統(tǒng)，美國通用電氣公司；UMAX Powerlook1100掃描儀，力廣科技股份有限公司；Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜儀，美國Bruker Daltonic公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

新鮮牛羊乳于4℃，5 000 r/min離心30 min，棄去上層脂肪，得脫脂牛羊乳[14]，取部分脫脂牛羊乳用1 mol/L HCl調(diào)pH至酪蛋白等電點(牛乳pH4.6，羊乳pH4.1)，靜置30 min后4℃，5 000 r/min，離心30 min取上清即為牛羊乳清。對脫脂牛羊乳和乳清進行冷凍干燥，并保存于-80℃下備用。

1.2.2 雙向電泳分析

第一向等電聚焦(IEF)，分別取脫脂牛羊乳及牛羊乳清凍干粉20 mg，各加入200μL再水化液RB(7 mol/L尿素、4%CHAPs、2 mol/L硫脲，雙蒸水溶解)充分混合溶解，在4℃下12 000 r/min離心20 min取上清液（即為樣品液），用考馬斯亮藍染色法定量測定。IEF采用固相pH梯度干膠條，根據(jù)蛋白質(zhì)定量結(jié)果取樣，硝酸銀染色的分析膠上樣量為40μg，而考馬斯亮藍染色的質(zhì)譜膠上樣量為500μg。上樣液的成分為：樣品液、1%IPG緩沖液、1%DTT、1×溴酚藍緩沖液、RB至460μL[15]。室溫20℃泡脹過夜（10～12 h），使膠條完全吸收上樣液。等電聚焦程序[16]為：300V 0∶30Hr，500V 1∶00Hr，1 000V 1∶00Hr，8 000V 3∶00Hr，8 000V 5∶20Hr，聚焦電壓：58kVh。

第二向SDS-PAGE，膠條復溫并進行平衡，先用100 mmol/L DTT的SDS平衡液平衡15 min，再用250 mmol/L IAA的SDS平衡液避光平衡15 min。SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%，上樣與電泳方法參照Qin[17]等的方法。電泳結(jié)束后對凝膠分別進行銀染或者考染，掃描銀染膠，圖像用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件分析。

1.2.3 質(zhì)譜前處理、質(zhì)譜分析鑒定及生物信息學分析

在質(zhì)譜（考染）膠上挖出需鑒定的點，對膠粒進行洗滌、脫色、脫水、干燥、胰酶（1μg/μL）酶切[2]，將提取的肽段用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為：UV波長355 nm；重復速率200 Hz；加速電壓20 000 V；最優(yōu)質(zhì)量分辨率1 500 u；掃描質(zhì)量范圍700～3 200 u；采用儀器默認模式獲得質(zhì)譜圖，胰酶自切峰為內(nèi)標校正質(zhì)譜儀，基線峰過濾、信號峰識別用flexAnalysis（Bruker Dalton）軟件進行。搜索NCBI數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)蛋白質(zhì)進行匹配鑒定，搜索UniPort蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/），將鑒定成功的蛋白質(zhì)信息轉(zhuǎn)換為基因名稱，然后利用mas3.0分子功能注釋系統(tǒng)（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/）進行GO注釋并分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂牛羊乳2-DE圖譜分析

2.1.1 2-DE圖譜分析

脫脂牛羊乳2-DE圖譜如圖1所示，主要酪蛋白集中在25～40 ku，主要乳清蛋白分布在15 ku處，此外還有許多低豐度蛋白點。將牛羊乳中所有蛋白點置于一張坐標圖上進行比較，如圖2所示，由圖可知牛羊乳蛋白整體分布差異不明顯，在羊乳中共發(fā)現(xiàn)659個蛋白點，牛乳中592個，其中酪蛋白與清蛋白的點數(shù)之和占脫脂乳總蛋白的60%左右，蛋白含量占70%以上。牛羊乳蛋白的分子量均處于0～160 ku，其等電點分布于4～7。Minh[18]等曾采取pH 3～10的IPG膠條對牛羊乳進行分析顯示大多蛋白仍分布于pH 4～7之間，與本實驗結(jié)果相同。

圖2 脫脂牛羊乳蛋白點分布

在銀染膠的酪蛋白區(qū)域選擇清晰且牛羊乳中差異較大的蛋白點（見圖1，圖中選取的牛乳酪蛋白斑點標注為b1～b10；羊乳酪蛋白斑點標注為g1～g11），并在考染膠上對應位點挖出對應蛋白點進行質(zhì)譜鑒定。

圖1 脫脂牛羊乳2-DE圖譜

2.1.2 脫脂牛羊乳蛋白分布特點

對脫脂牛羊乳2-DE圖譜中所有蛋白點分布進行分析，結(jié)果如圖3與圖4所示。圖3中分子量處于0～20 ku時牛乳的蛋白點數(shù)與含量均低于羊乳，乳清蛋白主要分布于此區(qū)域。分子量為20～40 ku時牛乳中蛋白點數(shù)及含量略高于羊乳，且酪蛋白多分布于此區(qū)域。在40～160 ku分子量區(qū)域內(nèi)存在多種低豐度蛋白，且牛乳蛋白點數(shù)略低于羊乳而蛋白含量高于羊乳。結(jié)合圖4可知，當?shù)入婞c為0～5時牛乳蛋白點數(shù)及含量均高于羊乳；而等電點為5～7時牛乳蛋白點數(shù)及含量低于羊乳，因此，從整體來看牛乳蛋白等電點低于羊乳。劉鳴暢[19]等人采用雙向電泳技術(shù)對牛羊乳蛋白進行分析，表明牛羊乳中αs1-CN與β-CN的等電點基本相同，但牛乳αs2-CN的等電點小于羊乳；在乳清蛋白中牛乳β-LG的等電點也小于羊乳，且兩者α-乳白蛋白的等電點基本相同，與本研究的結(jié)果類似。

圖3 脫脂牛羊乳蛋白分子量分布

圖4 脫脂牛羊乳蛋白等電點分布

2.1.3 牛羊乳主要酪蛋白圖譜比較

對占乳蛋白質(zhì)80%以上的酪蛋白進行了質(zhì)譜鑒定比較研究。乳酪蛋白主要有αs1-CN（區(qū)域A）、αs2-CN（區(qū)域B）、β-CN（區(qū)域C）、κ-CN（區(qū)域D）4類（比較如表1，在雙向電泳中的位置見圖1中的標注），其在2-DE圖譜中電泳行為存在一定差別。由表1可知，區(qū)域A處牛羊乳αs1-CN的等電點相同，而牛乳中分子量稍大于其在羊乳中的分子量，且蛋白點相對含量差別較大，牛乳為11.0%，羊乳為3.8%；區(qū)域B中牛羊乳αs2-CN也存在較大差異，羊乳中此類蛋白為一系列橫向排列的點，蛋白質(zhì)磷酸化修飾可能導致了其等電點的不同，Olumee[20]等發(fā)現(xiàn)羊乳αs2-CN中含有2個多磷酸肽和10個磷酸化位點，在等電聚焦過程中磷酸基團不斷解離使蛋白質(zhì)聚焦于不同的pH，而牛乳αs2-CN分布較為集中，相對含量為8.9%，高于羊乳中的3.3%；區(qū)域C中牛乳β-CN的相對含量為14.3%，羊乳為21.8%，兩者在電泳行為上無明顯差異[21]，而Costa[22]等認為薩能羊與高山羊2-DE圖譜中B區(qū)域一系列橫向排列的點為β-CN，C區(qū)域為αs2-CN；區(qū)域D主要分布的為κ-CN，牛乳κ-CN的等電點及蛋白點數(shù)較羊乳偏高，根據(jù)文獻顯示[23]，牛乳所有酪蛋白中只有κ-CN是糖基化的，因此磷酸化修飾及聚合程度的不同造成了牛羊乳κ-CN的差異。

表1 牛羊乳2-DE圖譜酪蛋白種類比較

2.2 牛羊乳清2-DE圖譜分析

2.2.1 2-DE圖譜分析

牛羊乳清2-DE圖譜如圖5所示，在牛乳中檢測到628個蛋白點，羊乳中650個，由圖可知在25～40 ku的酪蛋白區(qū)間仍含有少量蛋白斑點，但其含量甚微。圖中蛋白點大多分布于凝膠下方20 ku以下低分子量區(qū)間和上方40 ku以上的高分子量區(qū)間，其中低分子量區(qū)域主要分布乳清蛋白，高分子量區(qū)域主要分布牛羊乳低豐度蛋白。乳清蛋白主要包括β-LG（E區(qū)域）和α-LA（F區(qū)域），低豐度蛋白主要為一些酶類及活性蛋白成分[24]。在牛羊乳銀染膠上選擇清蛋白點（見圖5，牛乳清蛋白斑點標注為b11～b16；羊乳清蛋白斑點標注為g12～g15）和低豐度清蛋白（圖5中牛乳清低豐度蛋白斑點標注為b17～b26；羊乳清低豐度蛋白斑點標注為g16～g24），并在考染膠上對應位點挖出對應蛋白點進行質(zhì)譜鑒定。

圖5 牛羊乳清蛋白2-DE圖譜

2.2.2 牛羊乳主要清蛋白圖譜比較

牛羊乳清蛋白主要有β-LG（區(qū)域E）、α-LA（區(qū)域F），此外乳清中還有低豐度蛋白如血清白蛋白（區(qū)域G）（比較如表2，在雙向電泳中的位置見圖5中的標注）。牛乳α-LA的等電點略低于羊乳，蛋白點數(shù)與位置基本相同，因此牛羊乳α-LA無明顯差異。然而牛羊乳β-LG的雙向電泳行為存在顯著差別，牛乳β-LG斑點比羊乳β-LG更靠近酸性端，顯示牛乳β-LG的等電點低于羊乳，分子量與蛋白點數(shù)無明顯差別。血清白蛋白BSA處于70 ku分子量處，且牛羊乳中該蛋白電泳行為無明顯區(qū)別。

表2 牛羊乳2-DE圖譜清蛋白種類比較

2.3 牛羊乳蛋白質(zhì)譜鑒定

2.3.1 牛羊乳酪蛋白質(zhì)譜鑒定

在脫脂牛羊乳考染膠上挖出選定的酪蛋白質(zhì)斑點（圖1標示：b1～b10牛乳10個蛋白點，g1～g11羊乳11個蛋白點）進行質(zhì)譜鑒定，其中主要差異酪蛋白斑點的質(zhì)譜圖如圖6所示，可知肽段離子峰主要集中在750～2 500 m/z之間，且此類蛋白的匹配肽段數(shù)在2～2之間，匹配比率為11%～42%，牛羊乳中均鑒定出αs1-CN（b1～b3，g1～g2）、αs2-CN（b4，g5～g8）、β-CN（b10，g3～g4，g11）、κ-CN（b5～b9，g9～g10）4類酪蛋白。

圖6 牛羊乳主要差異酪蛋白點質(zhì)譜圖

搜索數(shù)據(jù)庫得到的蛋白理論等電點與分子量見表3，結(jié)合表1中各蛋白點所處區(qū)域pH范圍及分子量位置可知，牛羊乳中酪蛋白種類基本相同，但質(zhì)譜鑒定出的4類酪蛋白的理論分子量和等電點與圖譜中顯示的分子量和等電點存在差異，且牛羊乳中同種類蛋白的等電點也不相同，其原因可能為牛羊乳中同種蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同，不同的研究者鑒定該蛋白分子量與等電點的方法不同，且蛋白所處環(huán)境也可能不同，這些研究者的成果共同構(gòu)成了數(shù)據(jù)庫中該蛋白的理論等電點和分子量[25]。

表3 牛羊乳酪蛋白點質(zhì)譜鑒定信息

2.3.2 牛羊乳清蛋白質(zhì)譜鑒定

在牛羊乳清蛋白考染膠上挖出選定的清蛋白質(zhì)斑點進行質(zhì)譜鑒定，選擇牛乳清蛋白點6個（圖5標示：b11～b16）、羊乳清蛋白點4個（圖5標示：g12～g15），主要差異清蛋白點的質(zhì)譜圖見圖7，肽段離子峰主要分布在800～2 900 m/z之間，此類蛋白的匹配肽段數(shù)在3～9之間，匹配比率為19%～55%，鑒定結(jié)果顯示出β-LG（b11～b13，b15～b16，g15）、α-LA（b14，g12～g14）兩類清蛋白。b11～b13，b15～b16蛋白質(zhì)點的理論等電點與分子量分別為4.93和20 269 u；b14的為4.80和16 692 u；g15的為5.50和20 362 u；g12～g14的為5.06和16 700 u，結(jié)合表2可知，清蛋白在圖譜中顯示的等電點接近于理論等電點，顯示的分子量略小于理論分子量。同時在羊乳清2-DE圖譜區(qū)域E的左側(cè)存在一系列縱向排列的α-LA斑點（區(qū)域H），而牛乳清2-DE圖譜中不存在此類斑點，因此可用于區(qū)別牛羊乳。

圖7 牛羊乳主要差異清蛋白點質(zhì)譜圖

2.3.3 牛羊乳低豐度清蛋白質(zhì)譜鑒定

在牛羊乳清蛋白考染膠上端挖出選定的低豐度清蛋白斑點（牛乳10個b17～b26、羊乳9個g16～g24）進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示在牛乳中共鑒定出10種蛋白質(zhì)，羊乳中6種。其中絲氨酸蛋白酶系列（b17～b19,g17～g18）、補體成分3（點b23，g20～g21）、血清鐵傳遞蛋白（b25，g24）與聚免疫球蛋白受體（b26，g22～g23）在牛羊乳中均可鑒定出。Lu[26]等表明補體蛋白在山羊乳中的表達量高于其在牛乳中的含量。此外多種活性蛋白成分也在牛羊乳清中被鑒定出，如牛乳中的維生素D結(jié)合蛋白（b20）、α-1-抗糖蛋白（b21）、鋅-α-2-糖蛋白（b22）以及位于圖譜100 ku處的IgM重鏈恒定區(qū)（b24），而與牛乳絲氨酸A3-2（b17）對應位置的羊乳清圖譜中鑒定的蛋白為α-2-HS-糖蛋白（g16），與牛乳鋅-α-2-糖蛋白（b22）和IgM重鏈恒定區(qū)（b24）對應的分別為羊乳α-心肌1（g19）和聚免疫球蛋白受體（g22～g23）。因此牛羊乳中低豐度清蛋白種類繁多且不同，該類蛋白均可作為牛羊乳區(qū)別檢測的靶點。

2.4 牛羊乳蛋白生物信息學分析

對鑒定成功的15種牛乳蛋白與12種羊乳蛋白進行基因注釋，主要可分為分子功能（Molecular Function）、生物學途徑（Biological Process）和細胞組件（Celluar Component）3個層面，注釋結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。

圖8為分子功能層面上的比較。鑒定出的牛乳蛋白中檢測到的功能有黏附功能、轉(zhuǎn)運活性、分子功能監(jiān)管、抗氧化活性、轉(zhuǎn)移酶的活性等5類，其中有11種蛋白參與黏附功能，是蛋白參與最多的一種功能。而羊乳中檢測到了黏附功能、轉(zhuǎn)運活性、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、聚合物免疫球蛋白受體活性和受體活性等6類功能，且參與各種功能的蛋白種類相近。李春強[27]等研究發(fā)現(xiàn)黏附功能可以使蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)結(jié)合，形成結(jié)合蛋白，從而拓展蛋白功能，若其與抗原結(jié)合便可激活補體，促進吞噬作用。

圖8牛羊乳蛋白GO注釋（分子功能）

圖9 為生物學途徑層面上的比較。牛乳蛋白參與的生物學途徑有14類，以生物調(diào)節(jié)、刺激反應、定位、細胞過程、個體組織過程、代謝過程等為主。而羊乳蛋白參與的生物學途徑有11類，與牛乳相比多了受體集群與病毒反應兩種途徑，少了免疫系統(tǒng)過程、應對其他生物體、組織或生物起源細胞組件、抗氧化活性和細胞黏附5種途徑。張熙桐[28]等研究表明母乳、牛乳及羊乳3種乳中的清蛋白均在生物調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮最大作用，其次為對刺激的反應，且母乳中參與各種生物學途徑的蛋白種類數(shù)高于牛羊乳。

圖9牛羊乳蛋白GO注釋（生物學途徑）

圖10 為細胞組件層面上的比較。牛乳蛋白中檢測出的細胞組件包括細胞外區(qū)域、細胞、細胞器、細胞組分、高爾基腔、細胞器組分、膜、蛋白質(zhì)復合體等10類，羊乳蛋白中未測到細胞、高爾基腔與膜，但檢測到了膜的有機組成部分和細胞核兩類。葉清[29]等研究顯示在乳的細胞組件中，胞外區(qū)所占比例最大，在此區(qū)域會發(fā)生一系列細胞激活反應，也是大量分子發(fā)生結(jié)合的重要區(qū)域。

圖10 牛羊乳蛋白GO注釋（細胞組件）

目前對牛羊乳蛋白質(zhì)的研究一般采用蛋白質(zhì)組分析方法對總蛋白樣品進行研究，期望獲得更多種類的蛋白質(zhì)信息，如翁秀秀[30]等利用雙向電泳技術(shù)探究不同泌乳期湖羊脫脂乳蛋白質(zhì)組特征，以第一天初乳的2-DE圖譜為參照，分別在第3天、第7天、第14天、第28天、第56天檢測到了38、35、34、38、36個差異蛋白點，然而由于脫脂牛羊乳中酪蛋白含量占乳中總蛋白質(zhì)的80%以上，致使許多低豐度清蛋白不被檢出，酪蛋白和較高含量的清蛋白作為乳中重要的儲藏蛋白，它們對乳品加工特性及營養(yǎng)價值起決定性作用[31]。本研究采用等電點沉淀法去除酪蛋白的乳清樣品進行電泳分析，有利于大量低豐度乳清蛋白的檢出，清蛋白大多為具有生物活性的球蛋白，對其功能分析有利于探尋產(chǎn)乳動物的泌乳及生理特性[32]，其中一些蛋白還可以反映出乳腺的健康狀況。但由于該類蛋白含量低、易變性的特點[33]，使得進行蛋白組研究的重復穩(wěn)定性較差，本實驗采取低溫冷凍干燥制樣，使得實驗結(jié)果重復性較好。Yang[34]等利用相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)分析牛乳、耗牛乳、水牛乳、山羊乳與駱駝乳的乳清蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示共鑒定出211種蛋白質(zhì)，并分析了不同種類乳蛋白質(zhì)組學模式差異的顯著性，揭示了各物種的特征清蛋白，為評估上述乳品摻假提供了信息，然而此種方法只從蛋白種類與含量上分析了其差異，并未顯示其性質(zhì)差異，因此本研究采用雙向電泳技術(shù)分離乳蛋白，然后用質(zhì)譜鑒定并搜索數(shù)據(jù)庫得出各蛋白的分子結(jié)構(gòu)信息差異。本研究在牛羊乳離心脫脂過程中棄去了脂肪成分，其含有的乳脂肪球膜蛋白有待后續(xù)研究完善，對牛羊乳的蛋白質(zhì)組分析為牛羊乳蛋白質(zhì)的深入比較及摻假靶標研究奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過雙向電泳技術(shù)在脫脂牛乳中檢測到了595個蛋白點，脫脂羊乳中659個，牛乳清中628個，羊乳清中650個，脫脂牛羊乳中主要蛋白種類基本相似，但在2-DE圖譜中所處的位置卻不相同，主要是由于分子量與等電點存在差異，牛乳清與羊乳清的鑒定結(jié)果也類似。其中αs1-CN、αs2-CN、κ-CN及β-LG在2-DE圖譜中區(qū)別較大，牛乳中αs1-CN含量為11.0%,，遠高于羊乳的3.8%；牛乳中αs2-CN含量為8.9%，也高于羊乳中含量；牛乳κ-CN等電點為4.7～5.7，高于其在羊乳中等電點；牛乳β-LG的等電點為4.0～5.0，明顯高于其在羊乳中等電點，因此這4類蛋白可作為牛羊乳摻假的指示蛋白。通過質(zhì)譜分析確定了牛羊乳酪蛋白與清蛋白的分子結(jié)構(gòu)信息以及理論等電點與分子量，同時多種低豐度蛋白也在乳清中被鑒定出，如牛乳中特有的維生素D結(jié)合蛋白、絲氨酸蛋白酶及α-1-抗糖蛋白，羊乳中特有的α-2-HS-糖蛋白等，此外還對成功鑒定的乳蛋白進行基因注釋和功能差異分析比較，牛乳蛋白主要涉及抗氧化活性及細胞黏附等特有功能，而羊乳蛋白包括催化活性及與病毒反應等特有功能。因此牛羊乳中蛋白質(zhì)等電點及分子量差異、特有低豐度蛋白種類以及鑒定成功的蛋白功能差異均可作為牛羊乳區(qū)別檢測的靶點。