辛培源，楊振宇綜述 包國(guó)強(qiáng)審校

膽道惡性腫瘤(biliary tract cancers, BTC)約占消化道惡性腫瘤的3%，是起源于膽囊和膽管上皮的惡性腫瘤。根據(jù)腫瘤的發(fā)生部位，BTC分為膽囊癌(gallbladder carcinoma，GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA) ；BTC具有惡性程度高、早期診斷困難、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，其5年生存率在5%左右[1-2]；其發(fā)病隱匿，早期陽(yáng)性體征不明顯，出現(xiàn)癥狀往往已到疾病中晚期?，F(xiàn)階段臨床上常聯(lián)合非特異性腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9 等與增強(qiáng)CT、磁共振等影像學(xué)檢查進(jìn)行腫瘤的診斷和分期，但這2種方法特異度及性價(jià)比均不高[3]。近年來(lái)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)在腫瘤疾病的早期診斷、監(jiān)測(cè)治療效果、評(píng)估預(yù)后等方面逐漸嶄露頭角，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無(wú)創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)療效手段[4-5]。其檢測(cè)方式相對(duì)簡(jiǎn)便，與傳統(tǒng)檢查方法相比可早期發(fā)現(xiàn)病情變化，更加科學(xué)、迅速地評(píng)價(jià)治療方案的療效；且現(xiàn)在臨床上已有研究證實(shí)，CTCs對(duì)多種腫瘤的早期復(fù)發(fā)有預(yù)測(cè)功能，成為多種腫瘤的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[6]。CTCs作為一種全新的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤治療手段，開辟了臨床腫瘤學(xué)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的新格局,臨床前景廣闊[7]。因此建立基于“膽道系統(tǒng)惡性腫瘤特異性分子特征”的CTCs液體活檢系統(tǒng)，對(duì)于提高膽道系統(tǒng)惡性腫瘤患者早期診斷率和預(yù)后判斷有重要的臨床意義。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)概述

自19世紀(jì)澳大利亞醫(yī)生Ashworth提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs的概念以來(lái)，臨床上對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究一直在深入進(jìn)行。

1.1 CTCs來(lái)源與檢測(cè) CTCs一般從實(shí)體腫瘤(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)上脫落，進(jìn)入外周血液循環(huán)[8]。其中大部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)入人體外周血參與血液循環(huán)后，會(huì)被免疫細(xì)胞吞噬或發(fā)生凋亡，只有少數(shù)腫瘤細(xì)胞可以躲避機(jī)體免疫并逃逸，錨著在身體的其他器官或組織上發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，引起腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[9-10]。這些脫落的腫瘤細(xì)胞在血液中十分稀少，平均107個(gè)白細(xì)胞里含有1個(gè)CTCs，這也使得目前大量用于分離CTCs的技術(shù)都遵循著“富集”和“探測(cè)”的原則?！案患币蕾囉诩?xì)胞自身的物理屬性，而“探測(cè)”則通過免疫染色和顯微鏡或通過基于PCR的方法實(shí)現(xiàn)。目前在研究中最為成熟的檢測(cè)CTCs的方法是免疫磁捕獲法富集，即半自動(dòng)CellSearch平臺(tái)(Janssen Diagnostics，Raritan，NJ，USA)使用涂有上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的鐵磁珠對(duì)CTCs進(jìn)行富集，并根據(jù)形態(tài)特征、細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性表達(dá)和缺乏白細(xì)胞標(biāo)志物CD45來(lái)分辨CTCs[11-12]。

1.2 CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移 目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞理論、自我種植假說等現(xiàn)有的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)理論都認(rèn)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[13]。隨著臨床上對(duì)CTCs的研究不斷深入，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞在脫離腫瘤病灶進(jìn)入外周血循環(huán)的過程中會(huì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后可以促進(jìn)CTCs產(chǎn)生并且還可提高CTCs的生存率，EMT也可促進(jìn)CTCs轉(zhuǎn)變成為腫瘤轉(zhuǎn)移灶[14]。研究表明，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中重要的環(huán)節(jié)之一，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT是導(dǎo)致腫瘤預(yù)后差、耐藥性增加及治療效果降低的重要因素之一，發(fā)生EMT的CTCs不僅更容易于從腫瘤組織中分離出來(lái)，侵入到毛細(xì)血管中，提升自身生存能力和轉(zhuǎn)移潛力，而且還會(huì)出現(xiàn)型別的變化，形成上皮型、間質(zhì)型及上皮—間質(zhì)混合型等不同類別[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs不僅在外周血中以單個(gè)細(xì)胞存在，還會(huì)以細(xì)胞團(tuán)(CTM)形式存在。間質(zhì)型CTCs和CTM具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能，更容易在外周血液循環(huán)中存活，引發(fā)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[17]?？梢?，了解CTCs不同型別及其變化情況，對(duì)于指導(dǎo)腫瘤臨床治療至關(guān)重要。

1.3 CTCs與腫瘤預(yù)后 目前關(guān)于CTCs與膽道腫瘤新輔助化療療效相關(guān)性的報(bào)道較少。2017 年，Awasthi等[18]對(duì)CTCs在膽囊癌中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，在27例膽囊癌患者中，有25例在外周血中發(fā)現(xiàn)CTCs。研究中提到，利用CTCs計(jì)數(shù)在1的分界點(diǎn)來(lái)明確CTCs與膽囊癌的敏感度、特異度和診斷準(zhǔn)確性，其結(jié)果分別為 92.6%、91.7%和 92.3%。CTCs計(jì)數(shù)水平與已知預(yù)后指標(biāo)的臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)，在>4 的分界點(diǎn)具有顯著的診斷潛力，可區(qū)分疾病分期Ⅰ、Ⅱ 期和 Ⅲ、Ⅳ期 GBC。以>6為分界點(diǎn)可以鑒別轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性的 GBCs，其敏感度、特異度和診斷準(zhǔn)確性為 55.6%、100.0%和 85.2%。Sun等[19]對(duì)壺腹部癌的 CTCs展開相關(guān)研究，62 例樣本中 43 例(69.4%)每 3.2 ml全血可檢測(cè)到大于2個(gè) CTCs，其中 16 例(25.8%)可檢測(cè)到大于5個(gè)CTCs。以每3.2 ml全血2個(gè)CTC為界值，檢測(cè)敏感度為69.4%、特異度為95.8%，且與較短的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)相關(guān)。吳孟超團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，膽道惡性腫瘤患者外周血CTCs相比于良性疾病患者計(jì)數(shù)顯著升高，陽(yáng)性率增加，惡性膽道腫瘤的分期與外周血CTCs呈正相關(guān)[20]。而吳睿等[21]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CTCs技術(shù)作為一種診斷指標(biāo)在區(qū)分膽道惡性腫瘤疾病時(shí)，具有更高的診斷價(jià)值，可作為傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的輔助參考依據(jù)。溫志堅(jiān)[22]研究發(fā)現(xiàn)，CTCs是膽囊癌診斷、病情監(jiān)控和預(yù)后監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)，在膽囊癌的臨床診治中具有較大的研究和應(yīng)用價(jià)值。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，基于CTCs的潛在臨床價(jià)值通過組合 CD45、DAPI 和 CEP8-FISH 進(jìn)行檢測(cè)染色，CTC水平被證明與膽道壺腹腫瘤發(fā)展程度有關(guān)。Catenacci等[24]發(fā)現(xiàn)從胰膽管的入口采取靜脈血監(jiān)測(cè)其中CTC的數(shù)值，此技術(shù)可用于研究胰膽管腫瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展，協(xié)助診斷或預(yù)測(cè)，以分析癌癥復(fù)發(fā)或發(fā)展轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。Leelawat等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)血液中CTCs為預(yù)測(cè)晚期惡性膽道阻塞患者的整體生存提供了有價(jià)值的標(biāo)志。CTCs在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，CTCs的計(jì)數(shù)、分子分型和分子特性的相關(guān)檢測(cè)對(duì)于膽道系統(tǒng)惡性腫瘤的早期診斷、監(jiān)測(cè)治療效果、評(píng)判復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等有著重要的指導(dǎo)意義。

2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)

2.1 FGFR2的生物特性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,通過與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)結(jié)合參與體內(nèi)多種生理過程并發(fā)揮重要作用，其包括4種類型，即FGFR1～4，并在人體細(xì)胞中廣泛存在，參與機(jī)體的各種生化反應(yīng)，如胚胎發(fā)育過程中器官的生成，組織的修復(fù)和再生等[26]。 FGFs在新陳代謝、膽汁酸和礦物質(zhì)—磷酸鹽穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的分化、增殖和存活、調(diào)節(jié)組織纖維化、缺血性損傷后的心臟保護(hù)和上皮/傷口修復(fù)中都發(fā)揮著重要作用[27]。

2.2 FGFR與腫瘤發(fā)生的關(guān)系 FGFR在各種代謝及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡途徑中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)FGF-FGFR信號(hào)中的任何異常都可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[28-30]。FGF配體和FGF受體在硫酸肝素蛋白多糖的激活下，形成FGF-FGFR二聚體。FGF-FGFR二聚體復(fù)合物激活下游酪氨酸激酶通路，導(dǎo)致蛋白激酶C磷酸化。引起PI3K-Akt/蛋白激酶B通路、JAK/ STAT通路、RAS-MAPK-ERK通路及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的激活[31]。而細(xì)胞的增殖、凋亡等過程都與上述通路密切相關(guān)。因此，F(xiàn)GF-FGFR軸發(fā)生異常時(shí)則可通過影響細(xì)胞的存活/凋亡、增殖、遷移和血管生成過程，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。其致癌機(jī)制大致可歸因于染色體易位引起FGFR自身二聚化和激活、FGFs與促進(jìn)血管生成的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFs)相互作用和染色體畸變導(dǎo)致配體依賴和獨(dú)立的腫瘤形成和增殖三方面[32]。Molotkov等[33]研究指出，基因突變、重排或移位造成的FGFR2信號(hào)通路的改變?cè)诙喾N癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用?；蚪M學(xué)研究也提示，在膽管癌內(nèi)常見FGFR2融合，包括FGFR2-BICC1，F(xiàn)GFR2-AHCYL1，F(xiàn)GFR2-TACC3等[34]?？梢?，F(xiàn)GFR2在膽道惡性腫瘤的發(fā)生中起著極為重要的作用，因此將其作為新的治療靶點(diǎn)，是值得嘗試的新方向。

2.3 以FGFR2為靶點(diǎn)的治療現(xiàn)狀 隨著新的高通量分子生物學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展，臨床上已經(jīng)可以針對(duì)膽管癌中一些有效的基因治療靶點(diǎn)做出相關(guān)鑒定。有研究發(fā)現(xiàn)，特定的基因靶向治療藥物可有效地提升FGFR2基因表達(dá)異常膽管癌患者的預(yù)后[35-36]。2020年FDA數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)GFR2基因融合在膽管癌患者的發(fā)生率為9%～14%。在特定的膽管組織來(lái)源腫瘤中，這一比例甚至更高，在部分臨床研究中發(fā)現(xiàn)在肝內(nèi)膽管癌患者中，F(xiàn)GFR2基因融合/易位的發(fā)生率顯著升高[30, 37]。而在治療上，有研究發(fā)現(xiàn)某些靶向藥物，如BGJ398對(duì)存在FGFR2融合的膽管癌患者具有明確療效[38]。Wahiduzzaman等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)膽管癌細(xì)胞FGFR2基因過表達(dá)后48 h，細(xì)胞增殖能力較未做處理的對(duì)照組相比明顯增加，說明FGFR2基因表達(dá)具有促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖的作用。這些研究提示，F(xiàn)GFR2具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力，在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中也扮演著重要的角色。FGFR2的表達(dá)程度也與患者的預(yù)后緊密相關(guān)[40-41]。

研究表明，肝內(nèi)膽管癌可能攜帶突變的異檸檬酸脫氫酶基因(IDH1、IDH2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3)、Eph受體2(EPHA2)和BAP1(參與染色質(zhì)重塑的基因)，而且在肝內(nèi)膽管癌的病例中ARID1B、ELF3、PBRM1、cAMP依賴蛋白激酶A和蛋白激酶B的基因突變發(fā)生率更高。但是基因組研究表明，F(xiàn)GFR2畸變與約15%的肝內(nèi)膽管癌有關(guān)，與肝內(nèi)膽管癌的相關(guān)性更高[42]。有文獻(xiàn)指出3%～7%的膠質(zhì)細(xì)胞瘤、3%～6%的膀胱癌與FGFR的基因畸變相關(guān)。在小鼠模型中，誘導(dǎo)FGFR3的基因改變可以加速膠質(zhì)瘤樣腫瘤的進(jìn)展[43]。而FGFR2基因的過表達(dá)已在約有13.6%的病例中被證實(shí)與肝內(nèi)膽管癌相關(guān)[44]。現(xiàn)階段基于FGFR基因的研究是臨床上各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道日新月異，但其真實(shí)性、有效性仍有待臨床上進(jìn)一步探究論證。

3 CTCs聯(lián)合FGFR2與腫瘤療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后預(yù)測(cè)

特異性基因檢測(cè)已經(jīng)是癌癥病理檢測(cè)的重要組成部分。但現(xiàn)有基因檢測(cè)大多針對(duì)腫瘤病灶聚合的細(xì)胞，將正常組織細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞區(qū)別是當(dāng)前基因檢測(cè)的一大難點(diǎn)。即便NCCN要求所有需要做基因檢測(cè)的組織標(biāo)本均應(yīng)該先做常規(guī)病理檢查和HE染色以防止參雜正常組織細(xì)胞，仍然難以保證基因檢測(cè)樣本的純潔性[45]。

同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)CTCs發(fā)生腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)后，其基因表達(dá)相對(duì)于腫瘤組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生顯著改變，因此尋找CTCs各項(xiàng)基因表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞增殖的聯(lián)系有著重要的意義。其中，多個(gè)臨床研究發(fā)現(xiàn)FGFR2基因的過表達(dá)可提升腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移的幾率，同時(shí)CTCs細(xì)胞又與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。CTCs在腫瘤血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移的各個(gè)理論機(jī)制中均發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后生存、轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥能力均會(huì)增強(qiáng)，而FGFR2表達(dá)增加可能是其重要的原因。因此FGFR作為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子，其基因在CTC細(xì)胞的過表達(dá)可能是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因。CTC細(xì)胞上FGFR2的基因檢測(cè)有著為腫瘤轉(zhuǎn)移及基因治療揭示新的突破口的重要意義。

綜上所述，F(xiàn)GFR2基因的過表達(dá)具有促進(jìn)正常細(xì)胞和人膽道腫瘤細(xì)胞增殖的作用。但是目前對(duì)于FGFR2的研究主要集中在組織樣本中，對(duì)血液中CTC細(xì)胞上的FGFR2過表達(dá)的研究較為缺乏，這些研究有望進(jìn)一步揭示膽道腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

4 小結(jié)與展望

近年來(lái)，隨著對(duì) CTCs檢測(cè)技術(shù)不斷更新，CTCs對(duì)腫瘤患者的臨床應(yīng)用價(jià)值受到高度重視。綜述發(fā)現(xiàn)CTCs可作為膽道腫瘤不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，而且FGFR2基因與膽道腫瘤的不良預(yù)后及膽道腫瘤的微轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，目前針對(duì) CTCs和FGFR2與膽道腫瘤預(yù)后相關(guān)研究較少，但具有廣闊的臨床研究前景。得益于納米技術(shù)和多重RNA原位分析技術(shù)及單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床上實(shí)現(xiàn)了外周血中各類CTCs的檢測(cè)、分離。CTCs和FGFR2基因的檢測(cè)可成為膽道系統(tǒng)腫瘤免疫治療的新方向，從而指導(dǎo)抗癌藥的研發(fā)，改善患者的預(yù)后。CTCs及其FGFR2基因的檢測(cè)將會(huì)給臨床醫(yī)生對(duì)膽道系統(tǒng)惡性腫瘤患者的早期診斷、病情和療效的監(jiān)測(cè)評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的指標(biāo)，然而在其應(yīng)用于臨床前，仍需要進(jìn)行多中心、多變量、多領(lǐng)域的大型研究作為理論支撐。