劉建瑜,陳繼昌,傅錦堅△

1.桂平市人民醫(yī)院檢驗科，廣西貴港 537200；2.柳州市婦幼保健院預防保健科，廣西柳州 545001

B族鏈球菌(GBS)是革蘭陽性球菌，約15%～30%的健康女性生殖道或胃腸道中有GBS定植[1-2]。GBS可由孕產(chǎn)婦垂直傳播給新生兒，導致新生兒發(fā)生GBS侵襲性感染[3-4]。新生兒GBS侵襲性感染一直備受關(guān)注，因為GBS一旦入侵到新生兒無菌體液后，可導致患兒發(fā)生危及生命的腦膜炎、肺炎和敗血癥[5-6]。也有研究表明，一旦新生兒發(fā)生GBS侵襲性感染，其長期結(jié)局不容樂觀，可增加包括死亡和慢性病(如腦癱、癲癇病和各種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥)的發(fā)病風險[7-9]。多糖莢膜是GBS最重要的毒力因子，基于表面多糖結(jié)構(gòu)的差異，目前的分子方法已鑒定出10種公認的莢膜多糖血清型，即血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ至Ⅸ[10]。由于GBS血清型分布和攜帶率存在地理區(qū)域差異性，因而獲取本地GBS菌株的分子流行病學關(guān)鍵信息可為開發(fā)GBS疫苗及實施GBS預防策略的模型算法提供依據(jù)。本研究回顧性收集桂平市人民醫(yī)院分娩的新生兒以及外地轉(zhuǎn)診的感染性新生兒的GBS標本，并對GBS菌株抗菌藥物敏感性、血清型和分子特征進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年6月在桂平市人民醫(yī)院出生或由外院轉(zhuǎn)診至桂平市人民醫(yī)院的新生兒，出生時立刻采集標本(涂抹新生兒的耳朵、口腔和臍帶后放入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中)。經(jīng)外院轉(zhuǎn)診的新生兒，到本院新生兒科后，馬上使用無菌拭子采集咽部標本放入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中，送至檢驗科微生物實驗室進行培養(yǎng)。若出生后/經(jīng)由外院轉(zhuǎn)診至桂平市人民醫(yī)院進行救治的新生兒出現(xiàn)了氣促、呻吟、發(fā)紺或膚色蒼白等感染性癥狀，或體溫≥37.3 ℃，對此類患兒抽取2 mL血液進行培養(yǎng)，對出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征的患兒抽取腦脊液(床旁接種)進行培養(yǎng)，并將上述患兒轉(zhuǎn)到新生兒重癥監(jiān)護室(NICU)中進行治療。對分離鑒定為GBS的菌株，進一步分為定植菌株(定植組)和侵襲性感染菌株(感染組),即從血液、腦脊液等無菌體液中分離培養(yǎng)出的GBS菌株納入感染組[11]，從非無菌體液(新生兒的耳朵、口腔和臍帶)中檢出GBS菌株，且新生兒本身無感染癥狀、體征，該菌株納入定植組。本研究已經(jīng)得到桂平市人民醫(yī)院倫理委員會的審批(批文20170010)。

1.2GBS標本的分離鑒定 標本送至桂平市人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科臨床微生物學檢驗室后，半小時內(nèi)將標本接種于肉湯增菌培養(yǎng)基，在含有5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)、37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再轉(zhuǎn)種至GBS顯色培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h之后，挑選粉色、紫色、紅色等可疑陽性菌落至VITECK Compact 2鑒定儀(儀器購自法國生物梅里埃公司)中進行鑒定，確定分離株為GBS。對于腦脊液和血液等無菌體液的標本，放置血培養(yǎng)箱(儀器購自法國生物梅里埃公司)內(nèi)培養(yǎng)，報陽后抽出標本進行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平板，進一步進行分離鑒定，過程同上。

1.3抗菌藥物敏感性試驗和耐藥基因檢測 K-B紙片法用于GBS的抗菌藥物敏感性試驗，藥敏紙片的選擇和折點的判讀參照美國臨床與實驗室標準化協(xié)會提出的標準[12]。選擇青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、氯霉素、利奈唑胺和萬古霉素進行抗菌藥物敏感性試驗。多重耐藥的判定標準為菌株對≥3種不同類別的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。此外，四環(huán)素耐藥基因型(tetM、tetO、tetL、tetK、tetT和tetS)，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因型(ermA、ermB、ermC和mefA/E)和林可酰胺耐藥基因型(linB)的檢測使用聚合酶鏈反應(PCR)，操作程序和引物的設(shè)計方法等參考文獻[3]。

1.4GBS的分子特征分析 采用多重PCR方法檢測GBS的血清型，α樣蛋白基因[Alpha-C蛋白(alphaC)基因、rib基因、epsilon基因、α樣蛋白2/3(alp2/3)基因和α樣蛋白4(alp4)基因]和菌毛島基因(PI1、PI2a和PI2b)，引物的設(shè)計見參考文獻[3]，選擇生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因引物后，根據(jù)文獻[3]的PCR擴增步驟，對目的基因進行擴增。

1.5統(tǒng)計學處理 采用IBM23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。對血清型與α樣蛋白基因、菌毛島基因之間的關(guān)系，采用對應分析比較兩者之間的分布差異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1感染組和定植組的人口學和臨床特征分析 共從44例新生兒標本中分離出GBS，經(jīng)分析其臨床癥狀和特征，其中12例(27.3%)被納入感染組，其余32例(72.7%)被納入定植組。對上述兩組新生兒的人口學特征和臨床特征進行分析，結(jié)果顯示，感染組早產(chǎn)兒比例高于定植組(P=0.004)。見表1。

表1 感染組和定植組的人口學和臨床特征分析

2.2定植組與感染組的耐藥表型、耐藥基因型、α樣蛋白基因、菌毛島基因與血清型分析 所有的菌株對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素和利奈唑胺均敏感，對紅霉素和克林霉素均耐藥，對四環(huán)素、左氧氟沙星和氯霉素的耐藥率分別為79.5%、38.6%和6.8%，多重耐藥率達88.6%。感染組攜帶菌毛島基因PI2b和α樣蛋白基因rib的比例高于定植組(P<0.05)。定植組攜帶菌毛島基因PI2a和α樣蛋白基因alphaC的比例高于感染組(P<0.05)。定植組血清型Ⅰa型比例高于感染組(P<0.05)，而感染組血清型Ⅲ型比例高于定植組(P<0.05)。見表2。

表2 定植組與感染組的耐藥表型、耐藥基因型、α樣蛋白基因、菌毛島基因與血清型分析[n(%)]

2.3新生兒GBS菌株血清型與耐藥基因型、α樣蛋白基因和菌毛島基因的特征分析 四環(huán)素耐藥基因tetT更常見于血清型Ⅰa型菌株(P=0.043)；α樣蛋白基因alphaC基因常見于血清型Ⅰa型菌株(P<0.001)；α樣蛋白基因rib基因常見于血清型Ⅲ型菌株(P<0.001)。見表3。

表3 GBS菌株血清型與耐藥基因型、α樣蛋白基因和菌毛島基因的特征分析

2.4GBS菌株血清型與α樣蛋白基因、菌毛島基因的對應分析 對應分析結(jié)果顯示，α樣蛋白基因在不同血清型菌株中的分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.02，P<0.001)，表現(xiàn)為α樣蛋白基因rib、alp2/3更常見于血清型Ⅲ型菌株，而alphaC更常見于血清型Ⅰa型菌株，見圖1。菌毛島基因在不同血清型菌株中的分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.42，P=0.004)，表現(xiàn)為血清型Ⅲ型菌株更容易攜帶PI2b，而血清型Ⅰa型菌株更容易攜帶PI2a，見圖2。

圖1 GBS菌株血清型與α樣蛋白基因分布的對應分析

圖2 GBS菌株血清型與菌毛島基因分布的對應分析

3 討 論

一項納入5 315例GBS感染引起的新生兒遲發(fā)性菌血癥/腦膜炎病例的meta分析結(jié)果顯示，早產(chǎn)與GBS感染引起的新生兒遲發(fā)性菌血癥/腦膜炎風險顯著相關(guān)(OR=5.66,95%CI：4.43～7.22)[11]。此外，一項在丹麥和荷蘭進行的流行病學調(diào)查研究顯示，早產(chǎn)不僅可以導致GBS侵襲性感染的風險增加，且GBS感染與早產(chǎn)兩個危險因素疊加，致使新生兒發(fā)生腦神經(jīng)發(fā)育受損和死亡的風險明顯增加[13]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，感染組早產(chǎn)兒比例高于定植組(P=0.004)，提示GBS侵襲性感染的發(fā)生風險與早產(chǎn)兒的出生有關(guān)，早產(chǎn)是新生兒發(fā)生GBS感染的危險因素之一，未來的GBS疫苗研究應嘗試確定母體在妊娠期間接種GBS疫苗，且選擇最佳時間，以保護早產(chǎn)兒免受GBS侵襲性感染。

有研究顯示，GBS對大環(huán)內(nèi)酯類和克林霉素耐藥率在世界范圍均有逐步升高的趨勢[14-15]，且某些GBS菌株對萬古霉素和慶大霉素產(chǎn)生了耐藥[3]。有研究報道，GBS菌株對紅霉素和克林霉素產(chǎn)生耐藥的主要分子遺傳背景基礎(chǔ)與血清型Ⅲ型/序列型別ST17流行高度相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，所有的GBS菌株均對紅霉素和克林霉素耐藥，這與以往的研究報道相似[4]。我國報道的GBS菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率為58.0%～70.8%，而歐洲和北美洲報道的GBS菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率僅為11.5%和36.0%[4]。本研究結(jié)果表明，本地區(qū)臨床醫(yī)生不能使用紅霉素和/或克林霉素進行預防性用藥，在抗菌藥物選擇性壓力下，本地區(qū)的GBS菌株在不久的將來有可能對氨芐青霉素、青霉素和/或頭孢類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，最終會導致對青霉素不耐受患者的用藥選擇十分有限。

有研究結(jié)果顯示，從定植菌株和侵襲性感染菌株分離的GBS血清型的頻率相似[17]，但本研究結(jié)果顯示，定植組更容易攜帶血清型Ⅰa型而感染組更容易攜帶血清型Ⅲ型。GBS血清型Ⅲ型已成為亞洲最為流行的菌株之一，在所有的GBS侵襲性感染中所占的比例為32.2%～77.9%[16]。盡管GBS菌株的血清型隨時間和空間分布容易發(fā)生變化，但血清型Ⅲ型在新生兒群體分離的GBS菌株中比例一直在增加[16]。孕婦接種GBS疫苗是預防新生兒發(fā)生侵襲性感染的有效策略之一[18]。世界衛(wèi)生組織提出了加快GBS疫苗的研發(fā)速度以便降低新生兒GBS侵襲性感染的發(fā)病率和病死率[19]，在此情況下，本研究的結(jié)果為本地區(qū)GBS菌株的分子流行病學特征和血清型分布提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

迄今為止，基于表型和分子特征區(qū)分GBS克隆的數(shù)據(jù)較少。本研究觀察到某些血清型與α樣蛋白基因之間存在良好的一致性，且α樣蛋白基因與血清型的分布存在差異，如血清型Ⅲ-rib和血清型Ⅰa-alphaC，與此前的研究報道GBS的特定血清型-alp基因組合(如血清型Ⅴ-alp2/3，血清型Ⅲ-rib、血清型Ia-epsilon、血清型Ⅱ-rib和血清型Ⅰb-alp2/3)的結(jié)果相似[3,20]。此外，本研究觀察到alphaC存在于非血清型Ⅲ型的GBS菌株中。因此，若能研究出由alphaC和血清型Ⅲ型組成的結(jié)合疫苗即有可能對大多數(shù)GBS感染具有保護作用。

本研究觀察到每株GBS菌株至少可檢測出一種菌毛島基因，且根據(jù)對應分析結(jié)果，特定的血清型與菌毛島基因的分布具有一致性，如血清型Ⅲ型的GBS菌株更易攜帶菌毛島基因PI2b，血清型Ⅰa型的GBS菌株更易攜帶菌毛島基因PI2a，此發(fā)現(xiàn)與之前的研究報道結(jié)果一致[21]。有研究報道表明，菌毛島基因的存在可能會增加某些菌株在人體中的適應性和定植潛力，菌毛島基因可使GBS菌株錨定在孕產(chǎn)婦陰道內(nèi)并增加了隨后GBS垂直傳播的機會[22-23]。結(jié)合本研究結(jié)果和以往研究結(jié)論，可加深臨床醫(yī)生對不同標本來源和不同地區(qū)來源菌株的菌毛島基因分布模式和菌株遺傳背景多樣性的了解，并對未來基于菌毛島基因開發(fā)新的GBS疫苗提供啟示。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示本地區(qū)分離的新生兒GBS菌株對紅霉素和克林霉素有較高的耐藥性，強調(diào)了持續(xù)性監(jiān)測GBS菌株抗菌藥物敏感性的必要性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)GBS菌株特定的血清型-α樣蛋白基因和血清型-菌毛島基因的組合，即GBS菌株的α樣蛋白基因和菌毛島基因在不同血清型菌株中的分布存在差異性，凸顯了監(jiān)測GBS菌株的分子特征以發(fā)現(xiàn)GBS新的流行病學趨勢的價值，并為制訂新的GBS疫苗提供了本土流行病學依據(jù)。