杜夢卿，普珍，向蓓蓓

（天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

川西獐牙菜（Swertia mussotii）為一年生草本龍膽科被子植物，是常用藏藥材“桑蒂”的原植物之一[1]。在臨床中廣泛應用于急性黃疸型肝炎、膽囊炎、病毒性肝炎、水腫、流行性感冒、痢疾等多種疾病的治療，是治療肝膽疾病的良藥，有清熱解毒、清肝利膽之功效[2-3]。川西獐牙菜的主要化學成分為萜類、三萜類、環(huán)烯醚萜類等[4-5]，其主要有效成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷等均屬于環(huán)烯醚萜類化合物[6]。此外，石崢等[7]研究表明，川西獐牙菜的化學成分具有抗腫瘤的生物活性。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8-9]。有研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于植物中，幾乎參與了植物生長和代謝的每個方面[10]。通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛參與了初生和次生代謝、細胞分化、細胞發(fā)育過程以及響應脅迫的信號傳導過程[11]，在植物對非生物脅迫的響應過程中起重要調(diào)控作用[12]。

1987年，Paz-Ares首次在玉米中克隆了含有MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子C1基因，之后在植物中發(fā)現(xiàn)的MYB相關基因的數(shù)量迅速增加[11]。有研究表明，MYB參與調(diào)控花青素等黃酮類化合物的次生代謝，如玉米葉、花、種子中的花青素的合成含量受MYBCl調(diào)控，蘋果MdMYB9和MdMYB11通過與花青素合成酶、花青素還原酶和無色花青素還原酶的啟動子結(jié)合，調(diào)控花青素和原花青素的積累，擬南芥、龍膽中的MYB轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控黃酮類成分的積累[13-14]。近年來，對川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組的研究主要為MK（SmMk），而川西獐牙菜中MYB轉(zhuǎn)錄因子相關研究還未見報道。

本研究從川西獐牙菜幼葉中克隆MYB基因序列并對其進行生物信息學分析，為川西獐牙菜中萜類化合物的合成和改良等提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青海省玉樹縣采集野生川西獐牙菜的種子，經(jīng)青海大學董匯澤教授鑒定，試驗材料是在溫室條件下培養(yǎng)的川西獐牙菜幼葉。

大腸桿菌Rosetta和Escherichia coliTrans 5α菌種購于北京全式金生物技術股份有限公司，用于配置大腸桿菌LB液體培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器

Eastep Super總RNA提取試劑盒，普洛麥格（北京）生物技術有限公司；卡那霉素，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP，大連寶生物工程有限公司；5×T4 Ligase Buffer、TransStart Fast Pfu Fly DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer、DL2000 plus（2K plus）DNA marker，北京全式金生物技術股份有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀生物科技股份有限公司；引物合成和基因測序，深圳華大基因科技有限公司。

SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HNT-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司 ；Alpha-1860A紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司 ；TGL-16M高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；A200 PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，廣州深華生物技術有限公司。

1.3 方法

根據(jù)川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所獲得的MYB基因的序列和pEASY克隆載體pEASY-BluntCloning Vector的多克隆位點，設計一對引物為cDNA模板，序列如表1所示。

表1 引物序列表

對獐牙菜MYB基因進行PCR擴增，PCR反應體系總體積為 50 μL，含有 dNTP（2.5 mmol/L）4.5 μL，雙蒸餾水 24.5 μL，5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer 10 μL，川西獐牙菜 cDNA模板2 μL，Pfu DNA聚合酶（50 U/μL）3 μL，上游引物（10 μmol/L）3 μL，下游引物（10 μmol/L）3 μL。PCR的反應流程為：94 ℃變性7 min，94 ℃保護變性30 s，60 ℃引物模板退火完成30 s，72 ℃延伸并合成DNA 90 s，進行30個循環(huán)，結(jié)束后再72 ℃延伸10 min確保延伸完整。之后將其在4 ℃下進行儲存，為電泳法檢測PCR產(chǎn)物做準備。

2 結(jié)果與分析

2.1 川西獐牙菜MYB基因的開放閱讀框（ORF）的克隆

根據(jù)得到的轉(zhuǎn)錄組信息設計特異性引物，以獐牙菜總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用PCR技術進行擴增，得到一條清晰的1 158 bp的全長序列，推測編碼385個氨基酸，和預期大小符合。

2.2 理化性質(zhì)分析

利用 ExPASy Proteomics tool（https://www.expasy.org/）在線工具進行MYB蛋白氨基酸的理化性質(zhì)分析，得到MYB蛋白的分子式為C1841H2857N537O593S15，相對分子質(zhì)量為42 482.08 Da，等電點為6.02，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為39，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）為46，不穩(wěn)定系數(shù)為50.04，說明該類蛋白不穩(wěn)定。脂溶性系數(shù)為65.12，親水性系數(shù)為-0.688，說明該類蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)。

2.3 MYB蛋白亞細胞定位預測及信號肽的預測

使用在線軟件SignalP-3.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0）在線工具分析出了信號肽的各項值，結(jié)果如圖1所示。原始切割位點（C）評分為0.039，信號肽（S）評分為0.186，聯(lián)合切割位點（Y）評分為0.025，平均S評分為0.081，D分數(shù)（辨別分數(shù)）為0.053，表示該蛋白不含剪切位點，沒有信號肽。

圖1 MYB蛋白信號肽預測分析

使用PSORTⅡ（https://www.genscript.com/psort.html）在線工具推測獐牙菜MYB蛋白的亞細胞定位情況，結(jié)果顯示該蛋白定位在細胞核中的可能性為95.7%，定位在線粒體的可能性為4.3%。因此，推斷MYB蛋白亞細胞定位可能在細胞核中。

2.4 MYB蛋白跨膜區(qū)預測

使用在線工具TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0） 和NCBI數(shù) 據(jù) 庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 BLASTP程 序 對MYB蛋白預測了跨膜區(qū)，結(jié)果如圖2所示。該蛋白的1-385氨基酸位于細胞膜表面，因此可以推出MYB蛋白不具有跨膜區(qū)，表明此蛋白可能是非膜結(jié)合蛋白，整條多肽鏈均處于細胞膜外。

圖2 MYB蛋白的跨膜區(qū)預測

2.5 MYB蛋白多序列比對

使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTP程序和DNAMAN 8.0軟件對MYB蛋白進行了多序列比對。該蛋白與三龍膽、芝麻、煙草、小葉蟬、橄欖、南美煙草及黑毛黃耆中的該蛋白都有同源性，其中與三龍膽R2R3蛋白相似性最高，為70.90%；與黑毛黃耆的相似性最低，為62.01%。川西獐牙菜MYB蛋白存在多個保守區(qū)域，序列一致性達到71.03%。

2.6 進化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索與川西獐牙菜MYB蛋白序列相似性高的7條序列，利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示。川西獐牙菜MYB蛋白與三龍膽R2R3在同一個分支上，表明兩者之間親緣性較高。

圖3 MYB蛋白的進化樹分析

3 結(jié)論

有研究對白芷MYB蛋白家族進行亞細胞定位預測，有116個MYB蛋白都定位于細胞核中[15]。本試驗使用PSORTⅡ在線工具推測該蛋白的亞細胞定位情況，推斷川西獐牙菜MYB基因亞細胞定位可能在細胞核中，與前人研究結(jié)果一致；有研究表明，藏藥多刺綠絨蒿MhMYB3R蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，其529個氨基酸殘基均位于細胞膜外[16]。番茄SlMYB44蛋白最大疏水性值為1.533，最大親水性值為-3.411，沒有潛在的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白[17]。這些結(jié)果與本文研究一致。

本文基于轉(zhuǎn)錄學數(shù)據(jù)，利用生物信息學手段分析了MYB基因的ORF全長序列，設計特異性引物對該基因進行了克隆。從生物信息分析結(jié)果可以看出，MYB基因編碼蛋白的分子式為C1841H2857N537O593S15，等電點為6.02，相對分子質(zhì)量為42 482.08 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為50.04，說明該蛋白不穩(wěn)定；從氨基酸的組成成分看絲氨酸的占比最高（10.9%），而蛋氨酸的占比最少（1.6%）；采用PCR技術克隆的MYB基因ORF框全長為1 158 bp，推測編碼385個氨基酸，屬于PLN03091超級家族成員，亞細胞可能定位于細胞核；從多重序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果來看，川西獐牙菜MYB蛋白與三龍膽R2R3蛋白的親緣性最高。本試驗結(jié)果為進一步研究該基因的功能及利用基因工程手段提高川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜類化合物產(chǎn)量提供了理論依據(jù)。