康錦鈺，羅 佳，高澤天，鄭文濤，劉愛明，宋毓飛

(1.寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 浙江 寧波 315211； 2.寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院， 浙江 寧波 315211)

肝細(xì)胞以膽固醇為原料，經(jīng)由復(fù)雜的酶促反應(yīng)合成膽汁酸(bile acids，BAs)后，分泌到膽管，然后儲存在膽囊中；攝入食物后，BAs流入腸道，協(xié)助脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，最后經(jīng)門靜脈重新轉(zhuǎn)運至肝臟[1]。膽汁淤積癥(cholestasis)是由于免疫、遺傳、藥物和妊娠等多種因素引起B(yǎng)As代謝穩(wěn)態(tài)破壞，并導(dǎo)致毒性BAs在肝細(xì)胞、肝膽管和肝外膽道積聚的疾病[2]。常見的肝內(nèi)膽汁淤積癥病因包括原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)、非酒精性脂肪肝、藥源性肝損傷和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥等。持續(xù)膽汁淤積激發(fā)炎性反應(yīng)導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷稱為膽汁淤積性肝損傷(cholestatic liver injury，CLI)，若未及時糾正， 將進(jìn)一步導(dǎo)致膽管增生、纖維化，并發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌等[2]。

1 介導(dǎo)CLI發(fā)生的“直接毒性論”和“凋亡論”

實驗研究表明，BAs的脂溶性是決定BAs毒性的重要因素，BAs的脂溶性越強，肝毒性越強[3]。早期的研究多集中在BAs對肝臟的直接毒性作用，在體外實驗中，高濃度(1.5～2 mmol/L)的BAs可基于表面活性劑作用，直接破壞肝細(xì)胞膜，導(dǎo)致肝損傷[4]。然而，臨床膽汁淤積梗阻患者血清中毒性BAs組分甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)實際濃度范圍在22～32 μmol/L，遠(yuǎn)低于體外實驗濃度水平；而且使用28 μmol/L GCDCA處理人原代肝細(xì)胞時，并未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞死亡[5]。因此，BAs的直接毒性可能不是導(dǎo)致肝損傷的主要原因。

在小鼠肝細(xì)胞或人肝細(xì)胞模型中，100 μmol/L的BAs混合物可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此有學(xué)者提出了CLI的“凋亡論”[6]。但這一結(jié)論的實驗證據(jù)主要來源于體外肝細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?，而且BAs濃度高于100 μmol/L，而在膽汁淤積患者血清中測得的毒性BAs濃度(<30 μmol/L)很少能達(dá)到如此高的濃度水平[6]。且在膽管結(jié)扎術(shù)(bile duct ligation，BDL)模型小鼠血清中毒性BAs的最大濃度，如?；鞘懰?tauroclithoholic acid,TLCA 24 nmol/L)、脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA 130 nmol/L)、鵝脫氧膽酸(CDCA 13.8 nmol/L)、GCDCA(27 nmol/L)等僅是體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡所需濃度的千分之一。使用病理生理濃度的BAs分別處理人原代肝細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞，以及在BDL小鼠術(shù)后6～72 h內(nèi)，均未檢測到凋亡標(biāo)志物caspase-3的活性，ALT水平也沒有增加[7]?？偨Y(jié)以上數(shù)據(jù)可以看到，“凋亡論”也不能合理解釋CLI的機制。

2 中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)機制

炎性反應(yīng)可能是CLI發(fā)生的主要原因，近年來的研究多集中在CLI中炎性反應(yīng)的發(fā)生機制。BAs作為促炎介質(zhì)，能夠刺激趨化因子產(chǎn)生，使中性粒細(xì)胞向肝臟聚集，并釋放蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species ,ROS)等物質(zhì)殺傷肝細(xì)胞，通過增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并造成肝損傷[6]。

在C57BL/6小鼠行BDL術(shù)后6 h，BAs顯著上升，壞死區(qū)域中性粒細(xì)胞開始聚集，與組織損傷的時間起點一致，并在整個疾病過程中持續(xù)[7]。骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種趨化因子，被基質(zhì)金屬蛋白酶切割以后趨化能力明顯增強。在膽管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)小鼠模型術(shù)后24 h，肝臟壞死區(qū)及其周圍有大量中性粒細(xì)胞聚集，而Opn敲除小鼠肝臟中只有少量中性粒細(xì)胞聚集，但在72 h后，二者肝損傷指標(biāo)并沒有顯著差異。因此，OPN介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞聚集可能在早期膽汁淤積性肝損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。

BDL小鼠模型手術(shù)72 h后，OPN的作用逐漸被其他炎性介質(zhì)所取代，CXC家族趨化因子可能是其中之一。BAs作為促炎信號因子，可以觸發(fā)肝臟促炎因子的表達(dá)，將中性粒細(xì)胞聚集到膽管滲漏區(qū)域[9]。在Abcb4-/-膽汁淤積小鼠模型中，肝臟中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2)、CXC趨化因子配體-1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)和 CXC趨化因子配體-2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)的表達(dá)增加，中性粒細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)氨酶升高[6]。用病理生理濃度(25 μmol/L)的TCA處理小鼠原代肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞與巨噬細(xì)胞后，肝細(xì)胞中CCL2、CXCL2表達(dá)明顯增加，招募中性粒細(xì)胞聚集[9]。與對照組相比，Ccl2敲除小鼠在誘導(dǎo)膽汁淤積后，趨化因子CCL2的表達(dá)下降，肝損傷指標(biāo)減低，組織學(xué)上也幾乎沒有壞死區(qū)域。由此可見，CXC家族趨化因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞聚積在CLI中也發(fā)揮了重要作用。在Tlr9敲除小鼠的BDL模型中，趨化因子CCL2、CXCL2表達(dá)減少，因此BAs通過激活TLR依賴的信號通路觸發(fā)肝細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL2和CXCL2，從而激發(fā)炎性反應(yīng)[9]。

3 介導(dǎo)CLI炎性反應(yīng)的信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、P38等通路[10]。BAs對肝細(xì)胞的損傷與多條MAPK通路有關(guān)，在膽汁淤積早期，ERK1/2被激活，早期生長反應(yīng)調(diào)節(jié)因子-1(early growth response factor-1，EGR-1)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎性反應(yīng)細(xì)胞的聚集與活化，從而導(dǎo)致肝損傷[11]。在BDL模型小鼠中，肝實質(zhì)細(xì)胞中EGR-1水平迅速上調(diào)，使用ERK抑制劑預(yù)處理后，小鼠肝臟中EGR-1的上調(diào)也被抑制。Egr-1敲除小鼠行BDL術(shù)后， 趨化因子CXCL2和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表達(dá)上調(diào)均明顯減少，中性粒細(xì)胞聚集減少，肝損傷減輕。因此，ERK/EGR-1通路在CLI中可能發(fā)揮了重要的作用[11]。

CCL2表達(dá)上調(diào)可能與TLR通路相關(guān)，JNK、NF-κB和STAT3均受TLR4調(diào)控，且在BAs誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞炎性反應(yīng)中均被激活[12]。在BDL膽汁淤積模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，CCL2、CXCL1和CXCL2表達(dá)均明顯上調(diào)，JNK被持續(xù)激活，JNK的磷酸化顯著增加，而NF-κB影響不大[13]。脂多糖(lipopolysa-charide，LPS)是一種典型的TLR4激活劑，LPS刺激C6星狀細(xì)胞3 h后，CCL2表達(dá)增加25.5倍，JNK磷酸化水平迅速增加。JNK抑制劑SP600125可抑制LPS誘導(dǎo)的CCL2上調(diào)，而ERK抑制劑PD98059僅有輕微抑制作用[12]。因此，在LPS誘導(dǎo)CCL2的產(chǎn)生可能主要依賴JNK信號通路。

在BDL膽汁淤積模型小鼠和原發(fā)性膽汁淤積性患者中發(fā)現(xiàn)，BAs積累導(dǎo)致血清中TNF-α大量表達(dá)，可使JNK磷酸化增加。AP-1是c-FOS和c-JUN的異源二聚體，是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子。在α-異硫氰酸萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型中發(fā)現(xiàn)，c-JUN、c-FOS表達(dá)增加，JNK被強烈激活，趨化因子CCL2和 CXCL2的表達(dá)顯著上調(diào)，炎性因子IL-6、IL-10表達(dá)顯著升高[14]。給予AP-1抑制劑T5224后，趨化因子表達(dá)顯著下調(diào)。由上可見，JNK-AP1-CCL2/CXCL2軸在ANIT誘導(dǎo)的肝損傷模型的炎性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[14-15]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性模型小鼠中，JNK和STAT3磷酸化表達(dá)比對照組顯著增加，并與QPCR測得的其靶基因(JNK/AP-1：c-FOS和c-JUN；STAT3：SOCS3，F(xiàn)GA和FGB)的表達(dá)上調(diào)一致。由于STAT3是JNK下游的轉(zhuǎn)錄因子，JNK/STAT3信號軸的激活可能是肝損傷的主要原因之一[16]。

4 巨噬細(xì)胞在CLI中的作用

TGR5(G protein-coupled membrane receptor 5)是一種G蛋白偶聯(lián)BAs受體(GPBAR1)，在肝實質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，主要在Kupffer細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞和膽囊平滑肌細(xì)胞表達(dá)[17]。BAs喂養(yǎng)野生型小鼠和Tgr5敲除小鼠3 d后，野生型小鼠肝臟中IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著增加，而Tgr5敲除小鼠肝臟中IL-1β和TNF-α的表達(dá)無明顯變化，說明BAs激活TGR5可誘導(dǎo)小鼠IL-1β和TNF-α的表達(dá)。而NF-κB抑制劑BMS-345541和TGR5激活劑齊墩果酸(oleanolic acid，OA)處理巨噬細(xì)胞后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGR5介導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生與NF-κB無關(guān)，而與JNK的活化相關(guān)。因此，Kupffer細(xì)胞中的TGR5在CLI中起促進(jìn)作用，并通過JNK通路促進(jìn)下游炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[18]。

但也有研究表明TGR5可能在梗阻性膽汁淤積癥中起保護(hù)作用。與TGR5敲除小鼠相比，使用OA激活野生型小鼠TGR5后，Kupffer細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)增加[19]。體外實驗中OA處理Kupffer細(xì)胞后，cAMP表達(dá)增加了1.7倍，LPS誘導(dǎo)的IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子表達(dá)顯著下降，同時巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變[20]。因此，BAs也有可能通過TGR5-cAMP抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)，從而減輕肝損傷。

5 膽管細(xì)胞在CLI中的作用

PBC和PSC是以慢性炎性反應(yīng)、膽管損傷和最終肝纖維化為特征的膽汁淤積性肝病，其靶點是膽管細(xì)胞[21]。許多研究表明細(xì)胞衰老是PSC/PBC的固有特征，在PSC/PBC患者肝組織中發(fā)現(xiàn)衰老因子如P21、P16的表達(dá)上調(diào)，在門脈周圍肝細(xì)胞也有表達(dá)[21]。使用轉(zhuǎn)化生長因子β受體阻斷劑LY2157299處理膽道疾病小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，肝實質(zhì)的旁分泌細(xì)胞發(fā)生衰老，進(jìn)而損害肝實質(zhì)的再生能力[22]。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的膽管細(xì)胞衰老模型中，趨化因子CCL2和CX3CL1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的遷移。因此，衰老的膽管上皮細(xì)胞可能通過旁分泌調(diào)節(jié)膽管周圍微環(huán)境，并參與膽管的病理過程[23]。三羧酸循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶1突變代謝代謝產(chǎn)物2-羥基戊二酸能夠誘導(dǎo)膽管發(fā)生炎性反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，膽道內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，IL-10、IL-12表達(dá)增加[24]。另外膽管上皮細(xì)胞表達(dá)的促生長和趨化蛋白能夠招募中性粒細(xì)胞，刺激駐留的巨噬細(xì)胞和組織補體系統(tǒng)，導(dǎo)致局部組織炎性反應(yīng)[23]。

6 問題與展望

綜上所述，由于BAs代謝的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的治療通過干預(yù)BAs代謝治療CLI效果并不理想。不同原因引起膽汁淤積的生化本質(zhì)是相同的，因此介導(dǎo)CLI的炎性反應(yīng)過程很可能也是相同的；尋找并干預(yù)CLI的炎性反應(yīng)過程預(yù)期能夠阻斷肝損傷，保護(hù)肝細(xì)胞功能，從而有利于恢復(fù)正常的代謝功能。中性粒細(xì)胞的聚集介導(dǎo)CLI已基本成為共識，目前多數(shù)研究結(jié)果支持絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的亞家族在CLI炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，ERK、STAT3等通路發(fā)揮什么樣的作用需要更多的數(shù)據(jù)支撐，而多數(shù)研究不支持NF-κB通路對CLI產(chǎn)生關(guān)鍵作用。然而，在炎性反應(yīng)的上游，系統(tǒng)暴露的膽汁酸和肝細(xì)胞內(nèi)堆積的膽汁酸如何激活炎性反應(yīng)目前仍然知之甚少，有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)關(guān)鍵信號傳導(dǎo)過程，為開發(fā)新的治療方案提供依據(jù)。