李曉光，楊 璐，劉旭東，賈鑫淼，程燕飛，3，崔麗英

(中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 北京協和醫(yī)院 1.神經內科； 2.醫(yī)學科學研究中心，北京 100730；3.山西醫(yī)科大學 第七臨床醫(yī)學院 臨汾市人民醫(yī)院 神經內科, 山東 臨汾 041000)

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一組選擇性累及腦和脊髓運動神經元的致死性神經系統變性病，機制不明，尚無有效治療。遺傳因素在ALS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用， 目前認為ALS是多基因參與的復雜疾病，迄今已發(fā)現超過30個致病基因。有基因突變的患者和無基因突變的患者臨床表現，如肌萎縮及肌無力部位，進展速度等差別不大，發(fā)病年齡稍低。各種基因突變及無突變的病例涉及多種病理機制，包括內質網應激、線粒體功能異常、氧化應激、蛋白的錯誤折疊聚合和鈣超載、RNA/DNA調控異常及炎性反應等。其中小膠質細胞與星形膠質細胞介導的神經炎性反應在ALS運動神經元變性中的作用成為近年來研究熱點[1]。

ALS患者腦脊液和血液多種炎性細胞因子水平發(fā)生改變，支持神經炎性反應在導致進行性運動神經元丟失的致病機制中的作用，也提示其可能成為有助于ALS診斷、預后判斷的潛在特異性生物標志物及潛在的治療靶點。有研究發(fā)現，少數單個炎性細胞因子不具有足夠的敏感性和特異性作為特異性指標，需要結合其他指標[2]，也無治療成功的臨床試驗。因此，闡明各類型ALS中多種炎性細胞因子變化的規(guī)律，具有重要的臨床意義。本綜述介紹了ALS中相關炎性細胞因子研究的進展，并對文獻中報道的結果進行了分析，以期對今后的相關研究有所啟發(fā)。

1 神經炎性反應是肌萎縮側索硬化重要的病理機制

ALS患者的免疫系統失調導致中樞和外周炎性反應增加。神經炎性反應的特征是小膠質細胞激活、星形膠質細胞增生、T淋巴細胞和單核細胞浸潤以及炎性細胞因子的過度產生。小膠質細胞激活后分為MI型和M2型。M1型促進神經毒性T細胞反應，分泌活性氧和促炎因子,包括白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，以及減少保護性神經營養(yǎng)因子的分泌而具有細胞毒性。相反，M2型具有保護作用，可釋放高水平的抗感染細胞因子和神經營養(yǎng)因子，包括IL-4、IL-10和胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)以及與其他神經保護信號分子。

目前普遍認為ALS患者血液中的淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞通過白細胞介素、趨化因子、細胞黏附分子及受體等一系列分子之間的相互作用，可穿過血腦屏障并進一步破壞血腦屏障，進入中樞神經系統，導致腦脊液的改變及中樞神經系統炎性反應[3]。

在ALS患者體內發(fā)現單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，嗜酸粒細胞衍生神經毒素、嗜酸粒細胞趨化因子、C反應蛋白、TNFα等均有升髙，包括許多白細胞介素在內的大量炎性細胞因子和免疫細胞(如T調節(jié)細胞，Treg)和更快或更慢的進展相關[4]。這為進一步在更多患者及更細分組情況下確定其變化規(guī)律提供了堅實的數據。

2 肌萎縮側索硬化基因變異與炎性機制

對炎性過程研究有望將不同基因突變所致的ALS聯系起來，為ALS神經功能障礙和運動神經元退化的共同機制提供線索，可能加快對患者生物標志物的確定及治療干預途徑和靶點的確定。從1993年起已發(fā)現了數種導致ALS的突變基因。有些突變基因編碼的許多蛋白質可損害免疫系統功能，提供了免疫失調參與ALS發(fā)病機制的重要證據[5]。超氧化物歧化酶1(SOD1)、TAR-DNA結合蛋白(TAR-DNA binding protein，TARDBP)或C9orf72突變轉基因嚙齒動物模型及ALS患者出現中樞神經系統內的明顯炎性反應，這些突變基因的表達導致ALS樣病理改變及免疫功能障礙。編碼視神經素蛋白(optineurin，OPTN)、編碼絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)、編碼序列體1蛋白(sequestosome，SQSTM1，也稱為泛素結合蛋白p62)、編碼腫瘤壞死因子α誘導蛋白3相互作用蛋白1(TNF-α-induced protein 3-interacting proteins，TNIP1)、編碼含纈氨酸蛋白(valosin-containing protein，VCP)基因和編碼趨化因子受體1[chemokine (C-X3-C motif) receptor 1，CX3CR1]的基因等也有報道可直接損害免疫基因功能并促進炎性反應。這些突變基因是中樞神經系統和外周免疫系統驅動的炎性機制參與ALS發(fā)病機制的最直接證據。也提示自噬、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和下游核苷酸結合域樣受體蛋白3(NLR pyrin domain-containing protein3，NLRP3)炎性小體參與了ALS的發(fā)病機制。

OPTN基因是目前唯一被認為通過功能喪失突變導致經典ALS的已知基因。OPTN通常抑制NF-κB活性，NF-κB是先天性免疫反應的一個關鍵組成部分，在其缺失或突變形式下，NF-κB被轉移到細胞核，并促進大量促炎基因的表達，從而增強小膠質細胞介導的神經炎性反應。大多數研究認為突變的OPTN與NF-κB通路的失調有關，從而促進促炎性反應。OPTN基因也通過促進周圍免疫細胞中TBK1激活和干擾素(interferon)釋放調節(jié)炎性反應信號。因此OPTN/TBK1介導的IFN-軸調節(jié)失常導致受損神經元內免疫衰竭，易感于神經元退行性病變[6]。

TBK1基因無義及錯義突變可引起家族及散發(fā)性ALS和額顳癡呆，TBK1基因共分離和單倍體不足突變也會導致ALS和額顳癡呆[7]。TBK1蛋白結合并促使許多蛋白質磷酸化，包括OPTN和sequestosome-1/p62，并調節(jié)先天固有免疫和自噬。TBK1功能域的錯義突變可損害正常靶點的結合和磷酸化，提示功能缺失機制和截短突變類似[8]。

ALS患者有數種SQSTM1基因突變。SQSTM1基因編碼一種調節(jié)自噬和氧化應激的主要病理蛋白p62。SQSTM1的突變可改變p62的功能，并通過損害聚集蛋白降解和自噬而促進ALS的病理生理學[9]。

VCP基因突變可導致家族性和散發(fā)性ALS。VCP是自噬和ALS泛素化蛋白酶體途徑的重要組成部分。VCP突變損害整體蛋白質降解并導致TDP43沉積，導致包涵體肌病、Paget病、額顳癡呆和ALS[10]。

不同基因突變的ALS患者相關炎性細胞因子表達不同，SOD1基因突變ALS患者組從發(fā)病到死亡的時間長于C9orf72六核苷酸重復序列擴增ALS患者組和其他ALS患者組。其他ALS患者組腦脊液TNF-α高于C9orf72六核苷酸重復序列擴增ALS患者組。與其他ALS患者組和SOD1基因突變患者組相比，C9orf72六核苷酸重復序列擴增患者組的腦脊液IFN-α水平更高。ALS患者的生存率與IL-10呈負相關。其他ALS患者組血漿TNF-α、IL-10和TNF相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，C9orf72六核苷酸重復序列擴增患者組血漿IL-1β，SOD1基因突變ALS患者組腦脊液TRAIL均與生存率呈負相關[11]。這一研究進一步證實ALS各亞型的生存時間差異與細胞因子水平相關，表明不同ALS基因變異存在相關的特異性免疫反應。

3 炎性細胞因子做為臨床診斷、分型及預后生物標志物的研究

目前在ALS患者中檢測各種炎性細胞因子的研究較多，但結果差異較大。如肌酸激酶、鐵蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等水平普遍升高，而IFN-γ降低，認為ALS存在T細胞介導系統性調節(jié)的炎性標志物，結合各種變量綜合考慮，IL-6、TNF-α和IFN-g是調節(jié)幅度最大的標志物。轉鐵蛋白和IL-2高水平是短生存期的預測因子。IL-5水平與肌酸激酶成正相關，而TNF-α與神經微絲輕鏈(neurofilament light，NfL)成正相關。IL-6與C反應蛋白水平相關，在縱向觀察中顯示在患者終末期水平增加。在進展緩慢的ALS患者、男性患者、肢體起病、功能損害較小的ALS患者以及使用利魯唑治療的ALS患者中，血漿IL-6在6次就診中逐漸增加，表明IL-6在患者分層中可能有一定作用[4]。也發(fā)現ALS患者和對照組IL-4、IL-1b和IFN-γ水平存在顯著差異，ALS患者IL-4和IL-1b水平升高，而健康對照組的IFN-γ水平較高[12]。IL-6水平可區(qū)分ALS患者和正常對照，并可做為ALS診斷的生物標志物，IL-2水平的升高在ALS起保護作用[13]。而IL-6水平與年齡及呼吸功能有關，認為與疾病的炎性反應狀態(tài)無關[14]，有時ALS患者和對照組腦脊液和血液IL-6水平無差別，而TNF-α升高[15]。也發(fā)現TNF-α在ALS患者腦脊液和血液均升高[16]。腦脊液MCP-1、MIP-1a和IL-18以及血漿MCP-1和IL-18有可能是ALS患者存在炎性的標志物，神經微絲(neurofilaments，NFs)在ALS患者也升高，隨病程變化趨于穩(wěn)定，可預測疾病進展速度和生存率[17]。這意味著這類炎性標志物可以預測預后。

ALS患者腦脊液IL-6水平高于健康對照組和神經疾病對照組。ALS患者血清IL-6水平與健康對照組相比也有所升高，但與神經疾病對照組相比無顯著性差異。他們在所有患者均可觀察到血清IL-6R增加，只有ALS患者腦脊液IL-6R水平顯著升高。根據基因型比較，只有攜帶IL-6R C等位基因的ALS患者腦脊液IL-6水平升高，攜帶IL6R C等位基因的ALS患者ALSFRS-R評分下降幅度大于未攜帶IL-6R C等位基因的患者[18]，并認為這組患者可以進行以IL-6為靶點的治療[19]。

有此可見，尋找腦脊液和血液中與臨床表型相關的炎性細胞因子是研究熱點，但集中在少數幾個炎性細胞因子，結論不一致，尤其腦脊液與血液檢測結果差異較大。臨床收集腦脊液需進行有創(chuàng)的腰椎穿刺，限制了臨床常規(guī)應用。血液中炎性細胞因子水平受影響因素多，ALS患者血液中某些細胞因子的水平在第一次和第二次就診之間變化很大，甚至在某些情況下與健康對照組沒有差異，顯示出疾病的巨大異質性。前期研究主要的問題是樣本量較小，無法對患者進行發(fā)病部位、年齡及臨床分型及分期的亞組分析。

4 炎性細胞因子做為治療監(jiān)測指標的研究

在臨床藥物試驗中可利用炎性因子作為監(jiān)測治療反應的生物標志物及治療靶點。ALS患者的炎性反應是一個復雜過程，因此旨在降低炎性標志物豐度的治療有一定意義。

早期研究聯合使用阿納金拉和利魯唑治療中度進展的ALS和下運動神經元病患者，未觀察到對疾病進展的影響?；颊哐錓L-6和TNF-α有輕微下降。而纖維蛋白原水平顯著降低，血清中的C反應蛋白水平升高，表明這種藥物組合可能針對特定的炎性反應途徑[20]。

托珠單抗(tocilizumab)是一種基于抗體的治療藥物，可抑制IL-6和可溶性IL-6信號，已證明可降低治療24 h后散發(fā)性ALS患者外周血以及與活化巨噬細胞共培養(yǎng)的單核細胞中炎性介質的mRNA表達和蛋白分泌。向患者直接輸注托珠單抗可降低急性和縱向基礎炎性反應程度較高的散發(fā)性ALS患者血清許多炎性細胞因子的mRNA表達，并與ALSFRS-R評分的降低程度相關[21]。

由巴利昔單抗(basiliximab)、他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸酯(mycophenolate)和強的松組合的免疫抑制方案治療31個ALS患者6個月時ALSFRS-R無改善。但IL-2水平升高，在隨訪中逐漸下降[22]。

在低劑量IL-2每4周治療5 d為一個循環(huán)的臨床試驗中發(fā)現主要終點結局在第一循環(huán)治療后患者調節(jié)性T細胞 (regulatory T-cell，Treg)百分比顯著升高，次要結局在5個循環(huán)治療后Treg百分比依然與對照組有顯著差異，值得進一步評估減緩ALS疾病進展的效果[23]。

從治療角度，預后不良和病情進展緩慢的ALS患者從某一種治療中獲益程度是不同的。確定炎性細胞因子的水平與臨床表型，病程的關系是非常重要的，因為即使在無法改變致病基因突變直接結果的情況下，炎性過程可能成為分層指標及治療干預的靶點，或對疾病預后有一定預測作用。

5 問題與展望

ALS是一種多因素、多基因參與的疾病，不同的病理機制直接或間接導致運動神經元變性，神經炎性反應是這些機制之一。多項研究表明，ALS患者的神經炎性反應狀態(tài)并不總是相同，ALS患者中細胞因子水平及變化趨勢因疾病階段、ALS類型、患者全身狀態(tài)具有較大異質性。識別特定的細胞因子以幫助診斷、預測疾病的進展及候選靶點具有挑戰(zhàn)性。因此，應進一步研究ALS疾病進展過程中各種促炎和抗炎細胞因子的變化規(guī)律，了解其時間點激活及其與ALS中其他分子和臨床表現的關系，有助于根據ALS患者的炎性反應狀態(tài)進一步分層，從而更好地監(jiān)測疾病進展，并且開發(fā)針對這些關鍵免疫因子的更準確的治療方法。