權(quán) 瑩，張曉娟，趙 輝，孫曉敏，馬秀奇

（1陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2陜西理工大學(xué)體育學(xué)院，陜西漢中 723001；3陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西漢中 723001）

0 引言

基因組編輯技術(shù)是通過(guò)特定核酸酶對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯和修飾的一項(xiàng)技術(shù)。CRISPR/Cas9即規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9[1]，是目前最先進(jìn)也是應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)高效、簡(jiǎn)便的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，較之前的兩種基因編輯技術(shù)（ZFNs和TALENs)具有較大的優(yōu)勢(shì)。CRISPR/Cas9是根據(jù)細(xì)菌防御外界噬菌體侵染的分子機(jī)制構(gòu)建的體系。它是由RNA介導(dǎo)，借助Cas9蛋白對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割，然后通過(guò)機(jī)體的修復(fù)機(jī)制將DNA重新連接，或?qū)⑿禄虿迦氲交蚪M中的一項(xiàng)基因編輯技術(shù)[2]。該技術(shù)在基礎(chǔ)研究、作物育種、基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9應(yīng)用于植物領(lǐng)域，具有特異性較高、脫靶率低的特點(diǎn)[3-4]，是作物育種改良快速、有效、安全的途徑，它可對(duì)多個(gè)基因同時(shí)編輯，促進(jìn)育種向高效、快速、低成本方向發(fā)展。近年來(lái)，該系統(tǒng)已在高粱[5]、玉米[6]、番茄[7]、油菜[8]、大麥[8]、矮牽牛[9]、葡萄[10]、甜橙[11]、大豆[12]、棉花[13]、楊樹(shù)[14]、甘蔗[15]等多種作物中取得成功應(yīng)用，發(fā)展前景廣闊。

1 CRISPR/Cas9的原理及優(yōu)點(diǎn)

CRISPR/Cas普遍存在于古生菌和細(xì)菌中，其作為細(xì)菌/古生菌的獲得性免疫系統(tǒng)，能夠特異識(shí)別并降解再次入侵的外源DNA分子（如噬菌體等）[16-17]。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)組成包括兩部分，即高度保守的重復(fù)序列以及位于其間的間隔序列，間隔序列的作用是特異性識(shí)別外源DNA分子。外源DNA分子入侵宿主時(shí)，前者DNA中的原型間隔序列被Cas9蛋白特異切割，之后整合到宿主的CRISPR位點(diǎn)，成為CRISPR間隔序列。當(dāng)其再次入侵時(shí)，宿主DNA中的“重復(fù)-間隔”序列轉(zhuǎn)錄、加工成小的crRNA，然后與tracrRNA(trans-activating crRNA)配對(duì)結(jié)合，之后識(shí)別、結(jié)合Cas9蛋白并最終形成RNA-蛋白復(fù)合體[18]。該復(fù)合體特異識(shí)別入侵DNA分子中的原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)，PAM的存在是導(dǎo)致其上游的原間隔序列被切割的先決條件。crRNA中的間隔序列通過(guò)與入侵DNA上的原間隔序列互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)外源DNA特異性切割[19-20]，引起DNA雙鏈斷裂，接著由宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)[21-22]，從而形成基因組定點(diǎn)插入、缺失等編輯。

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型。其中，Ⅱ型系統(tǒng)僅有1個(gè)Cas蛋白，也就是Cas9蛋白，其核酸酶切割功能域由Ruv C和HNH結(jié)構(gòu)域組成，可分別切割靶DNA雙鏈[23]。II型系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單，CRISPR/Cas9技術(shù)就是由該系統(tǒng)改造而來(lái)的。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢(shì)。首先，該技術(shù)非常簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，研究者只需要設(shè)計(jì)合成20 bp的sgRNA。其次，CRISPR/Cas9系統(tǒng)生物安全性高，通過(guò)回交分離，該技術(shù)可獲得無(wú)外源基因的類(lèi)似于自然突變的突變株系[24]。再次，CRISPR/Cas9技術(shù)可同時(shí)編輯多個(gè)靶基因，將其應(yīng)用于多倍體植物基因功能研究[25]，可解決植物中由于存在多個(gè)同源基因或者多個(gè)基因平行參與某個(gè)信號(hào)途徑，導(dǎo)致的單個(gè)基因敲除并不能產(chǎn)生功能變化的問(wèn)題。此外，該技術(shù)克服了分子標(biāo)記輔助育種中的連鎖累贅和分子標(biāo)記丟失問(wèn)題，對(duì)作物的其他性狀基本沒(méi)有影響。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)影響因素及優(yōu)化改進(jìn)

Jinek等[20]將crRNA和tracrRNA合并，形成一條單鏈引導(dǎo)RNA（即sgRNA），由該RNA引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶序列實(shí)施定點(diǎn)切割，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡(jiǎn)化改造。研究者只需要根據(jù)靶基因NGG位點(diǎn)上游20個(gè)堿基設(shè)計(jì)一條sgRNA，即可通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速實(shí)現(xiàn)靶基因的切割、編輯。在水稻中的研究表明，使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA兩者配合使用效率更高[26]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于植物基因編輯，其突變效率和特異性受sgRNA、Cas9蛋白、靶序列及啟動(dòng)子等因素影響，對(duì)這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化，可提高該系統(tǒng)的效率和精確性[27-28]。sgRNA序列對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性具有主要決定作用，Cas9切割位點(diǎn)的確定由sgRNA與靶序列配對(duì)完成。設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)，應(yīng)保證其序列特異性。測(cè)序分析表明，sgRNA的3′端序列與靶DNA的配對(duì)對(duì)于識(shí)別和介導(dǎo)靶基因突變更為重要，3′端距離PAM的8～12個(gè)序列主要影響sgRNA的特異性，是sgRNA的核心序列[29]。sgRNA的GC含量也影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，在其5′端添加2個(gè)堿基GG，可減低其脫靶率[30]。sgRNA長(zhǎng)度一般設(shè)計(jì)為17～20 nt；適當(dāng)縮短sgRNA的長(zhǎng)度（15個(gè)堿基）可減少脫靶率，但編輯效率會(huì)降低[31]。sgRNA的表達(dá)量[32]及表達(dá)策略也影響CRISPR/Cas9的編輯效率[33]。

對(duì)Cas9核酸酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性。通過(guò)突變Cas9蛋白的RuvC或HNH結(jié)構(gòu)域，將其改造為僅能切割單鏈DNA的單切口酶，將后者與“paired-g RNAs”結(jié)合進(jìn)行基因組編輯，可有效提高系統(tǒng)特異性[34]。此外，增加Cas9的切口酶活性能減少脫靶效應(yīng)[35]。Cas9基因的表達(dá)水平也影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率[36]。

CRISPR/Cas9中，靶序列組成、GC含量影響靶DNA的切割效率[37]。水稻中研究表明，GC含量高(50%～70%)的目標(biāo)基因組具有較高的編輯效率[27]。

啟動(dòng)子也是影響Cas9基因表達(dá)水平以及基因編輯效率的關(guān)鍵因素。在水稻中，用Ubiquitin啟動(dòng)子編輯效率明顯高于CaMV35S啟動(dòng)子[38]。在雙子葉植物中，采用CaMV35S啟動(dòng)子可高效表達(dá)Cas9基因[39]。此外，PAM序列，一般為NGG，也對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯效率存在影響。除了識(shí)別NGG外，NRG（R代表A或G）也可被Cas9識(shí)別，但切割頻率顯著降低，只有NGG的1/5[40]。

3 在植物基因功能及基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)可快速地對(duì)基因進(jìn)行敲除，為植物基因功能、基因表達(dá)調(diào)控及功能基因組學(xué)等研究提供了快速有效的途徑。

3.1 基因定點(diǎn)敲除或插入

目前，通過(guò)基因敲除進(jìn)行編輯為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中應(yīng)用的主要方式。堿基刪除數(shù)目越多，出現(xiàn)的頻率越低[27]。Wang等[41]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻品種‘空育131’的負(fù)調(diào)控稻瘟病菌抗性及耐鹽性的OsERF922基因進(jìn)行敲除，得到抗稻瘟病的突變材料。王凱婕等[42]利用該技術(shù)對(duì)水稻OsRhoGDI2基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，獲得的突變體株高較對(duì)照顯著降低。

外源基因的插入，可通過(guò)HDR途徑，采用導(dǎo)入含目的基因同源臂的外源DNA實(shí)現(xiàn)[43]。Schiml等[44]首次通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以?xún)啥撕信c間隔序列相同的DNA為模板，將NPTII基因片段通過(guò)DNA的同源重組修復(fù)機(jī)制成功導(dǎo)入擬南芥ADHI基因位點(diǎn)。沈春修[45]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)耐冷性較強(qiáng)的粳稻品種LOC_Os10g05490位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，得到了基因敲除突變體。

3.2 基因表達(dá)調(diào)控研究

CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)改造后可用于基因表達(dá)調(diào)控研究。突變Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC），將Cas9蛋白改造成僅具有DNA結(jié)合功能的缺陷型核酸酶dCas9，然后與具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白結(jié)合，在crRNA引導(dǎo)下，識(shí)別靶基因并對(duì)其進(jìn)行激活或抑制[18]。

CRISPRi(CRISPR interference)又稱(chēng)CRISPR干擾。該系統(tǒng)將dCas9與KRAB、SID、RNAP等具有轉(zhuǎn)錄阻遏功能的結(jié)構(gòu)域融合，對(duì)靶基因進(jìn)行抑制[46]。Piatek[47]利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域SRDX與dCas9蛋白的C端融合形成dCas9-SRDX，成功在煙草中干擾了PDS基因的表達(dá)。

CRISPR-on系統(tǒng)則具有轉(zhuǎn)錄激活活性作用。該系統(tǒng)中，dCas蛋白與VP16/VP64、p65、EDLL等轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，從而激活靶基因的表達(dá)[48]。Zetche等[49]基于FRB和FKBP兩者互作，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子VP64對(duì)靶基因表達(dá)的促進(jìn)。

此外，研究者們還開(kāi)發(fā)了以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)。Zalatan等[50]對(duì)dCas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，將sgRNA轉(zhuǎn)化為具有招募RNA結(jié)合蛋白功能的scRNA(scaffold RNA)，通過(guò)連接在RNA結(jié)合蛋白上的效應(yīng)蛋白對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

4 CRISPR/Cas9用于植物基因組定點(diǎn)編輯及作物分子育種

4.1 植物基因組定點(diǎn)編輯

目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物基因定點(diǎn)突變及基因定點(diǎn)整合等研究。Zhang等[51]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在水稻不同亞種中，選擇11個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，T0代植株中突變效率即達(dá)到了66.7%，且有6個(gè)靶位點(diǎn)為純合基因型。擬南芥中，廖嘉明等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了擴(kuò)展蛋白EXPA的多基因編輯表達(dá)載體pHEE401E-AtEXPAs，實(shí)現(xiàn)了擬南芥擴(kuò)展蛋白的多基因突變。Wang等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在六倍體小麥中對(duì)單個(gè)TaMLO位點(diǎn)進(jìn)行編輯，在T0轉(zhuǎn)基因株系中鑒定到4株突變位點(diǎn)不同的突變體。Abe等[54]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式，成功獲得調(diào)控小麥休眠的Qsd1基因的三重敲除突變體。

CRISPR/Cas9技術(shù)還可同時(shí)修飾多倍體植物中的不同同源基因。Braatz等[55]僅使用一個(gè)靶序列，在T1代油菜中實(shí)現(xiàn)了ALC的4個(gè)等位基因同時(shí)突變。

4.2 CRISPR/Cas9在作物分子育種中的應(yīng)用

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，作物遺傳改良已經(jīng)由常規(guī)雜交向高效、精準(zhǔn)的定向育種轉(zhuǎn)變。CRISPR/Cas9技術(shù)可對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)編輯和修飾，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中隨機(jī)插入導(dǎo)致的內(nèi)源基因失活、外源基因沉默等缺點(diǎn)，在作物品種定向改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制作物重要性狀的基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，如對(duì)控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性的負(fù)調(diào)控因子進(jìn)行敲除，調(diào)控相關(guān)代謝過(guò)程，可快速獲得具有優(yōu)良性狀的突變體，大大縮短優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗作物新品種的選育周期[56]。

徐鵬等[57]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)稻瘟病抗性相關(guān)基因進(jìn)行編輯，獲得了抗性明顯增強(qiáng)的水稻Pi21單突變純合株系及三基因（Pita、Pi21和ERF922）突變純合株系，為水稻抗稻瘟病育種提供了育種材料。Xu等[58]對(duì)控制粒重的3個(gè)基因（GW2、GW5和TGW6）同時(shí)進(jìn)行基因定點(diǎn)編輯，得到粒重較對(duì)照明顯增加的gw5tgw6二基因突變體和gw2gw5tgw6三基因突變體，可用于水稻高產(chǎn)育種。汪秉坤等[59]對(duì)水稻直鏈淀粉基因-Waxy(Wx)進(jìn)行定點(diǎn)敲除，得到低直鏈淀粉含量并且可穩(wěn)定遺傳的株系，直鏈淀粉含量由之前的17.5%降至1.93%。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)控制花粉或花藥發(fā)育過(guò)程的基因進(jìn)行編輯可快速創(chuàng)制新型不育系，促進(jìn)水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用[60]。覃玉芬等[61]通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)TMS5基因進(jìn)行編輯，T0代純合突變體高達(dá)58.4%，研究獲得了無(wú)外源DNA的溫敏雄性核不育系GXU41-5S。

小麥中，Zhang等[62]報(bào)道了基于突變植株瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9 DNA（縮寫(xiě)為T(mén)ECCDNA）的基因組編輯方法。該研究對(duì)控制小麥籽粒長(zhǎng)度和重量的TaGASR7基因和控制花序結(jié)構(gòu)并影響穗生長(zhǎng)和籽粒產(chǎn)量的TaDEP1基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，在T0代即獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的純合敲除突變體。

玉米中，Svitashev等[63]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)ALS2基因定向敲除，獲得了抗磺胺脲除草劑的突變體植株。Shi等[64]利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了玉米AGROS8突變體，該突變體抗旱性增強(qiáng)且在干旱脅迫下仍有較高產(chǎn)量。

5 問(wèn)題及展望

CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中應(yīng)用雖然具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足，主要表現(xiàn)為CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在脫靶現(xiàn)象[65]，需進(jìn)一步提高其特異性。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在通過(guò)同源重組(HDR)方式定點(diǎn)導(dǎo)入基因效率較低的問(wèn)題，需進(jìn)一步改造該系統(tǒng)，提高基因靶向?qū)胄?。Miki等[66]以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合二代轉(zhuǎn)化策略，在擬南芥中實(shí)現(xiàn)了超長(zhǎng)DNA片段的高效精確敲入及替換。它不需要標(biāo)記輔助篩選，插入或替換效率高達(dá)5%～10%。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一項(xiàng)簡(jiǎn)單、高效、低成本且安全性較高的作物育種新技術(shù)，大大提高了作物遺傳改良和良種選育的效率，推動(dòng)了作物精確育種研究。今后，通過(guò)HDR方式定向?qū)肟刂浦匾r(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因以及通過(guò)基因定點(diǎn)整合實(shí)現(xiàn)多個(gè)優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的聚合將成為該技術(shù)在作物遺傳改良以及育種中的重點(diǎn)研究方向。

CRISPR/Cas9技術(shù)在植物表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域同樣具有良好的應(yīng)用價(jià)值。將dCas9與甲基化酶、磷酸化酶等表觀修飾因子融合對(duì)染色體進(jìn)行定點(diǎn)表觀修飾，可以研究特定基因表觀修飾的功能[18]。將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與單分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)染色體、基因構(gòu)象及動(dòng)力學(xué)的研究[67]。CRISPR/Cas9技術(shù)還可用于調(diào)控植株代謝網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)對(duì)某個(gè)代謝途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，從而對(duì)植株代謝進(jìn)行調(diào)控，提高次生代謝物含量，在提高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)減少藥用植物資源的采挖，保護(hù)植物資源。Cas9/sgRNA系統(tǒng)在病毒防御中也具有很好的應(yīng)用前景。利用Cas9蛋白對(duì)病毒基因或受體基因進(jìn)行突變從而阻止病菌入侵，是植物抗病毒研究的有效方法[68]。