周碧云，伍 慶

(貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001)

花椒(學(xué)名：ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是指蕓香科植物花椒的干燥成熟果皮。花椒作為傳統(tǒng)調(diào)味品和中藥，不僅具有賦味、增香、解膩等作用[1-2]，更具有抗癌、麻醉、鎮(zhèn)痛、抑菌、殺蟲等功效[3-5]。

受種植地環(huán)境影響，各地的花椒品質(zhì)差異較大，尤其花椒所含有揮發(fā)性物質(zhì)具有不同香味，這些揮發(fā)性物質(zhì)的組合形成花椒的獨(dú)特香氣[6-11]。近年文獻(xiàn)對(duì)各品種花椒的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，但對(duì)其定量方法多數(shù)采用面積歸一化法，面積歸一化法是一種粗略定量、半定量方法，存在結(jié)果不夠準(zhǔn)確，無法準(zhǔn)確定量等局限性，在花椒的質(zhì)量控制上存在一定的限制[12-17]。一測(cè)多評(píng)法是確定某一成分為內(nèi)參物，建立其與其他成分的相對(duì)校正因子，再通過相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分含量[18-21]。本方法可在只有一種對(duì)照品的情況下同時(shí)測(cè)定多種成分，已被用于多種中藥材及食品質(zhì)量評(píng)價(jià)中。

本研究選擇檸檬烯作為內(nèi)參物，建立QAMS法同時(shí)測(cè)定花椒中6種揮發(fā)性成分含量方法，該方法簡(jiǎn)單、可靠、耐用性好，可全面控制花椒的質(zhì)量，為其質(zhì)量評(píng)判提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B、Agilent 6890氣相色譜儀(美國Agilent公司)；Agilent HP-5、Agilent HP-1、Agilent DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國Agilent公司)；XS-105 型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；CH-250 超聲波清洗機(jī)(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所)。

1.2 材料與試劑

花椒(分別來源于甘肅、陜西、山西、四川)；檸檬烯(批號(hào)：ZHT8J-TG，≥98%)購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；桉油精(批號(hào)：wkq18040410，≥98%)、乙酸芳樟酯(批號(hào)：wkq20113004，≥98%)、α-蒎烯(批號(hào)：wkq18044081，≥98%)、芳樟醇(批號(hào)：wkq19010802，≥98%)均購自四川維克奇生物科技有限公司；β-石竹烯(批號(hào)：20200716，≥90%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、丙二酸二乙酯等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣：氮?dú)?純度>99.999%)；氫火焰離子檢測(cè)器溫度：230 ℃；程序升溫(初始溫度35 ℃，以5 ℃/min升至70 ℃，保持7 min；再以1 ℃/min升至86 ℃，保持2 min；并立即以6 ℃/min 升至140 ℃，再立即以10 ℃/min 升至190 ℃)；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；進(jìn)樣量：0.2 μL；分流比：50∶1。色譜圖見圖1。

圖1 花椒揮發(fā)性成分氣相色譜圖

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備

精密稱取內(nèi)標(biāo)丙二酸二乙酯適量，加乙醇稀釋并定容，配制濃度為27.708 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。移取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，加乙醇稀釋，定容，得到濃度為5.541 6 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別精密稱取α-蒎烯、檸檬烯、桉油精、芳樟醇、乙酸芳樟酯和β-石竹烯適量，加乙醇稀釋并定容，配制成濃度分別為0.283 6 mg/mL、11.040 0 mg/mL、1.664 8 mg/mL、3.120 0 mg/mL、0.925 6 mg/mL、0.316 8 mg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液。精密移取1.25 mL混標(biāo)儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，乙醇稀釋定容至刻度，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備

將花椒干燥樣品進(jìn)行粉碎，過40目篩，精密稱取2.5 g于具塞錐形瓶中，精密移取5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，稱定質(zhì)量，超聲15 min，補(bǔ)重，搖勻，濾過，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察

分別精密移取1.00 mL、1.25 mL、2.50 mL、3.50 mL混標(biāo)儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶中，再分別加入1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，乙醇稀釋定容至刻度，即得一系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密移取系列混標(biāo)溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以各物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)(X)，各物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，6種成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 6個(gè)揮發(fā)性成分回歸方程與線性范圍

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積，計(jì)算RSD值。得出α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分別為1.14%、0.78%、1.61%、1.30%、1.98%和1.85%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次花椒粉末樣品6份，按“2.1.4”項(xiàng)制備供試品溶液進(jìn)樣分析，計(jì)算RSD值。結(jié)果α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分別為1.42%、1.52%、1.61%、1.53%、1.80%和1.90%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分別為1.11%、1.78%、1.90%、1.77%、1.96%和0.97%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率考察

精密稱取已知待測(cè)成分含量樣品粉末1.25 g于錐形瓶中，共9份，分別加入待測(cè)成分含量的50%、100%和150%。按“2.1.4”項(xiàng)制備供試品溶液進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積并計(jì)算平均加樣回收率和RSD值。結(jié)果見表2，表明本方法具有良好的回收率。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算

分別取系列混標(biāo)溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各待測(cè)成分的峰面積，根據(jù)相對(duì)校正因子的計(jì)算公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[22]，式中Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度，Am為待測(cè)組分m的峰面積，Wm為待測(cè)組分m的質(zhì)量或濃度，以檸檬烯為內(nèi)參物，計(jì)算其與其他5種揮發(fā)性成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表3。

表3 5種揮發(fā)性成分與檸檬烯的相對(duì)校正因子

2.3 耐用性考察

2.3.1 相對(duì)校正因子的耐用性

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算相對(duì)校正因子。考察色譜儀(Agilent 7890B、Agilent 6890)及色譜柱(HP-1、HP-5、DB-5)對(duì)相對(duì)校正因子的影響。測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 不同儀器和不同色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.3.2 色譜峰定位

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算以檸檬烯為內(nèi)參物，其他揮發(fā)性成分的相對(duì)保留時(shí)間?？疾焐V儀(Agilent7890B、Agilent 6890)及色譜柱(HP-1、HP-5、DB-5)對(duì)待測(cè)組分的相對(duì)保留時(shí)間的影響。測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 不同儀器色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

2.4 一測(cè)多評(píng)法與內(nèi)標(biāo)法結(jié)果比較研究

分別取甘肅、陜西、山西和四川4地花椒，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)地區(qū)花椒制備兩份平行供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用內(nèi)標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法對(duì)花椒中的6種揮發(fā)性成分含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，兩種測(cè)定結(jié)果之間無顯著性差異(P>0.05)。

表6 QAMS與內(nèi)標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=2)

3 結(jié)論與討論

QAMS法是確定某一易得、價(jià)廉、有效、穩(wěn)定的成分為內(nèi)參物，建立其與其他成分的相對(duì)校正因子，再通過相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分含量，本方法可在只有一種對(duì)照品的低成本情況下同時(shí)測(cè)定多種成分。本研究發(fā)現(xiàn)，檸檬烯和桉油精在花椒的含量均較高且較穩(wěn)定，并且價(jià)格都較為低廉。從樣品出峰來看，檸檬烯出峰時(shí)間更早，且干擾峰較桉油精更少。因此，根據(jù)QAMS法內(nèi)參物選擇原則，本實(shí)驗(yàn)選擇檸檬烯作為內(nèi)參物進(jìn)行QAMS含量測(cè)定。

此外，本研究在進(jìn)行QAMS法與內(nèi)標(biāo)法測(cè)定花椒6種揮發(fā)性成分含量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)之前，考察了不同色譜儀、色譜柱對(duì)花椒中建立的6種揮發(fā)性成分的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果表明相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定、可靠。而后采用內(nèi)標(biāo)法和QAMS法對(duì)花椒中6種揮發(fā)性成分進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，結(jié)果表明兩種測(cè)定結(jié)果之間無顯著性差異，表明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可為花椒提供質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。