吳新文，吳華秀，于以竹，黃永橋，張世芹，田乙卜，曹俊杰，楊昌彪

(1貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550002；2貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550002)

0 引言

抹茶源自中國。宋時，飲茶方法由唐代的煮茶演變?yōu)辄c茶，形成宋代獨特精致且復(fù)雜的點茶藝術(shù)。元代至明代，散茶取代了餅茶與團(tuán)茶，人們飲用時將散茶放入壺或盞內(nèi)，直接沖泡，至此抹茶的飲用方式漸漸地退出歷史舞臺[1]。近年來，抹茶行業(yè)的發(fā)展呈現(xiàn)快速上升的趨勢，我國從事抹茶加工的茶企數(shù)量逐年增多，生產(chǎn)規(guī)模和市場需求不斷在擴(kuò)大[2]。抹茶是一種純天然超細(xì)微粉體綠茶，它最大限度地保持了綠茶的天然綠色以及營養(yǎng)、藥理成分，有很強的表面吸附力及親和力、固香性及良好的懸浮穩(wěn)定性等特性，并易被吸收[3]。抹茶的食用方式人體將會獲得很多茶葉中的脂溶性活性成分，而普通的泡茶引用茶湯的方式是沒辦法獲得的。茶葉中含有豐富的葉黃素、β-胡蘿卜素[4-5]，經(jīng)測定抹茶中也同樣含有豐富的β-胡蘿卜素、葉黃素和維生素E。葉黃素是一種天然存在的類蘿卜素，它是視網(wǎng)膜中黃斑色素的重要組成部分，可以過濾藍(lán)光，防止視網(wǎng)膜損傷，同時葉黃素還是靈長類動物腦部最重要的類胡蘿卜素，不僅可以通過血腦屏障，還可能對維持大腦功能有特殊作用，對維持年長者的認(rèn)知能力、語言能力有利[6]。β-胡蘿卜素是良好的維生素A源，在抗氧化、抗炎、增強免疫、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用[7]。維生素E是人體維持多種生理活動不可替代，又不能自身合成，必須從外界攝取的營養(yǎng)元素，是一種天然的抗氧化劑[7]。抹茶中葉黃素、β-胡蘿卜素、維生素E的含量可作為評價抹茶品質(zhì)的重要指標(biāo)。

目前對葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E的檢測通常都使用常規(guī)的高效液相色譜法[4-9]，這類方法基本選擇紫外檢測器進(jìn)行檢測，葉黃素很容易干擾維生素E的定量，同時前處理非常繁瑣，加上這三類物質(zhì)較為不穩(wěn)定，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性很難保證。目前有采用在線凈化和中心切割技術(shù)結(jié)合液相色譜檢測維生素、葛根素和芍藥苷等檢測項目的[10-16]，也有采用液相色譜紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器檢測抗生素、多環(huán)芳烴等檢測項目的[17-18]，但是采用在線SPE凈化結(jié)合液相色譜-紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器同時測定抹茶中葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E的文獻(xiàn)還非常少。本研究采用兩泵一閥搭建在線SPE-HPLC-紫外串聯(lián)熒光檢測器分離系統(tǒng)，建立快速分析方法。該方法樣品經(jīng)皂化后可直接進(jìn)行儀器分析，可同時檢測抹茶中的葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E。該分析方法簡單、快速、高效、定量準(zhǔn)確、成本低，完全迎合了目前檢測方法的發(fā)展需求。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、葉黃素(純度≥90.0%，TRC)，β-胡蘿卜素(純度≥96.9%，ANPEL)，無水乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司)，甲醇、乙腈(分析純，科密歐)，磷酸、氫氧化鉀(優(yōu)級純，科密歐)，BHT、抗壞血酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，ONLINE PLRP-S固相萃取柱(15～20 μm，4.6 mm×12.5 mm)、poroshell 120 PFP色譜柱(4.6 mm×100 mm，4 μm)(美國Agilent公司)，抹茶(貴州某抹茶生產(chǎn)公司)。

1.1.2 儀器

Agilent1260液相(配有1個四元泵、1個二元泵、1個兩位六通閥、1個三通接頭、1紫外檢測器、1個熒光檢測器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱)(美國Agilent公司)，HH-6J數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)，TG16W高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)，ME204天平(美國梅特勒-托利多公司)，vortex-genie2渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取葉黃素、β-胡蘿卜素、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚10 mg于不同的容量瓶中，用無水乙醇定容至100 mL，配置成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.2 樣品的前處理

取2 g抹茶樣品于棕色皂化瓶中，加入0.1 g BHT和1 g抗壞血酸，加入20 mL水溶解，加入30 mL乙醇，再加入25 mL 50%氫氧化鉀溶液，加入攪拌子，置于恒溫磁力攪拌水浴鍋中，80 ℃回流皂化40 min，取出冷卻，加無水乙醇定容至100 mL，混勻，12000 r/min離心5 min，取上清液過膜上機測定。

1.2.3 儀器條件

儀器搭建如圖1所示，皂化液凈化柱(SPE柱)：ONLINE PLRP-S(15～20 μm，4.6 mm×12.5 mm)，分析色譜柱：poroshell 120 PFP色譜柱(4.6 mm×100 mm，4 μm)，進(jìn)樣量：100 μL，柱溫：35 ℃，紫外檢測器：檢測波長445 nm，熒光檢測器：激發(fā)波長294 nm、發(fā)射波長328 nm，SPE泵參數(shù)條件見表1，分析泵參數(shù)條件見表2，閥切換時間見表3。

圖1 在線SPE-HPLC-紫外串聯(lián)熒光檢測器系統(tǒng)流路示意圖

表1 SPE泵參數(shù)條件

表2 分析泵參數(shù)條件

表3 閥切換時間

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)處理

從1.2.1配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備液中移取不同的體積按照1.2.2進(jìn)行處理，得到標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品處理液按照1.2.3的色譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化時間的選擇

按照1.2.2方法，抹茶樣品選擇在80 ℃水浴中回流皂化20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，結(jié)果如圖2所示。皂化時間從20 min增加到40 min時，各檢測組分含量都有不同程度的增加，皂化40 min時樣品可能已經(jīng)皂化完全，各組分測定含量達(dá)到最大值，繼續(xù)延長皂化時間，4種生育酚含量基本上保持不變，而葉黃素和β-胡蘿卜素測定含量明顯下降，這可能是因為皂化時間太長目標(biāo)物被氧化的原因。所以皂化時間選擇40 min時效果最佳。

圖2 皂化時間的選擇

2.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對葉黃素、β-胡蘿卜素和4種生育酚進(jìn)行光譜掃描，如圖3所示，葉黃素和β-胡蘿卜素在445 nm處有較大吸收，在294 nm處也有吸收；4種生育酚在294 nm處有較大吸收，在445 nm處基本上沒有吸收。選擇294 nm作為檢測波長，色譜圖如圖4所示，4種生育酚、葉黃素、β-胡蘿卜素都有響應(yīng)，葉黃素和γ-生育酚的保留時間非常接近，很難分離，葉黃素會影響γ-生育酚的定量。選擇445 nm為檢測波長時，如圖5所示，4種生育酚基本上沒有響應(yīng)，葉黃素和β-胡蘿卜素的分離度可滿足實驗定性、定量要求。選擇熒光檢測器294 nm作為激發(fā)波長，328 nm作為發(fā)射波長進(jìn)行檢測時，色譜圖如圖6所示，葉黃素、β-胡蘿卜素基本沒有響應(yīng)，4種生育酚分離度可滿足實驗定性、定量要求。綜合考慮，最后選擇紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器的方法同時進(jìn)行檢測，選擇波長445 nm作為葉黃素和β-胡蘿卜素的檢測條件，選擇激發(fā)波長294 nm、發(fā)射波長328 nm作為4種生育酚的檢測條件。

圖3 維生素E(4種生育酚)、葉黃素、β-胡蘿卜素光譜圖

圖4 檢測波長為294nm時的色譜圖

圖5 檢測波長為445nm時的色譜圖

圖6 檢測器為熒光檢測器時的色譜圖

2.3 在線SPE凈化閥切換時間驗證

分析過程中，皂化液進(jìn)樣后經(jīng)在線 SPE 柱凈化，目標(biāo)物被吸附，樣品基質(zhì)和強堿溶液經(jīng)兩位六通閥切換到廢液管路排出色譜系統(tǒng)外，不對液相色譜分離系統(tǒng)造成任何破壞，閥的位置如圖7所示，此時液相色譜分離系統(tǒng)處于上樣階段，液相色譜分離系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。SPE 柱經(jīng)六通閥切換，閥切換到圖8所示的位置，轉(zhuǎn)入液相色譜分離系統(tǒng)，此時 SPE 柱與液相色譜柱串聯(lián)作為分離系統(tǒng)。當(dāng)閥再次切換到圖8所示位置時為SPE凈化柱的再生過程。閥從圖7位置切換到圖8位置的時間設(shè)置太早將會導(dǎo)致凈化效果不理想，殘留的堿液和雜質(zhì)會影響后面的分離系統(tǒng)；設(shè)置時間太晚，目標(biāo)物將有可能流失，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。閥從圖8位置切換到圖7位置的時間設(shè)置太早時，目標(biāo)物質(zhì)有可能沒有完全洗脫進(jìn)入后面的分離系統(tǒng)；切閥時間設(shè)置太晚時，部分雜質(zhì)會洗脫進(jìn)入后面分離系統(tǒng)，干擾目標(biāo)物質(zhì)，同時過多的洗脫溶劑會改變流動相的極性，影響目標(biāo)物的保留時間、峰型和分離度。通過對在線SPE柱廢液和洗脫液中目標(biāo)物質(zhì)的檢測和pH值的測定以及獲得的色譜圖進(jìn)行綜合考慮，確定閥從圖7位置切換到圖8位置的時間為4.5 min，從圖8位置切換到圖7位置的時間為5.9 min，樣品圖譜如圖9所示，獲得的峰型良好，分離度良好，基本無雜質(zhì)干擾。

圖7 樣品在線凈化與SPE柱再生位置

圖8 目標(biāo)物質(zhì)洗脫的位置

圖9 抹茶樣品的色譜圖

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性、定量限、精密度、準(zhǔn)確度的驗證

以化合物峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)建立各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表4所示，葉黃素、β-胡蘿卜素、維生素E的線性均大于0.99，在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

以S/N=10計算葉黃素、β-胡蘿卜素、維生素E的儀器定量限；按試驗1.2的條件驗證各化合物方法定量，如表4，葉黃素定量限為0.004 mg/kg，β-胡蘿卜素定量限為0.005 mg/kg，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚定量限為0.020 mg/kg，σ-生育酚定量限為0.015 mg/kg。確定的方法定量限均不高于抹茶中各組分的含量，該方法滿足抹茶中的葉黃素、β-胡蘿卜素、維生素E測定的定量要求。

表4 方法的線性范圍、回歸方程及定量限

選抹茶2號樣品進(jìn)行6次重復(fù)性試驗，并對該樣品進(jìn)行3水平加標(biāo)試驗，每個加標(biāo)水平重復(fù)進(jìn)行6次重復(fù)試驗，結(jié)果如表5所示，6種化合物的 3 水平加標(biāo)的回收率均在87.0%～112%之間，回收率良好。6 種化合物3水平6次重復(fù)性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～5.6%之間，精密度良好。

表5 方法的回收率和精密度

2.4.2 實際樣品的測定

選擇6種抹茶進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表6所示，抹茶樣品6種化合物的含量均高于方法定量限，不同抹茶樣品6種化合物的含量均存在一定的差異性。

表6 抹茶樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗以兩泵一閥雙檢測器搭建了在線SPE-HPLC-紫外串聯(lián)熒光檢測器同時測定抹茶中的葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E的檢測方法，本方法經(jīng)皂化后可直接上機測定葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E，免去了三個檢測項目不同檢測方法的復(fù)雜前處理操作，選擇在線SPE富集、凈化目標(biāo)組分，避免耗費大量溶劑，大大縮短了前處理的時間，同時也避免了繁瑣步驟對目標(biāo)物定量造成的影響，操作簡單，自動化程度高，可批量檢測樣品，完全迎合了目前檢測方法的發(fā)展需求。且經(jīng)方法學(xué)驗證，目標(biāo)化合物在0.020～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，線性良好，對6個抹茶產(chǎn)品進(jìn)行測定，穩(wěn)定性良好，可作為實驗室檢測抹茶中葉黃素、β-胡蘿卜素和維生素E的檢測方法。