黃 睿，李 鈺，何文絢*，盧先勇，陳為健，陳 婷，張燕杰

1.閩江學(xué)院材料與工程系，福建 福州 350108 2.福建省測(cè)試技術(shù)研究所,福建 福州 350003

引 言

植物油由可皂化物和不皂化物兩類物質(zhì)構(gòu)成。可皂化物占98.5%～99.5%，主要是各種脂肪酸甘油酯，種類多達(dá)百種；不皂化物占0.5%～1.5%，主要包括各種植物甾醇、生育酚、角鯊烯、色素等[1-2]。由于食用植物油成分復(fù)雜，加上各種食用植物油成分非常相似，因此，在食用植物油摻假中最難篩查的是它們之間的摻假(以下簡(jiǎn)稱摻假植物油)如高價(jià)油中摻入低價(jià)油。摻假植物油不僅影響到廣大消費(fèi)者的身體健康，也破壞了食用油行業(yè)的生產(chǎn)規(guī)范，違反我國(guó)食品安全法[3]。縱觀植物油鑒定/摻假植物油篩查方法，主要有色譜法(包括其聯(lián)用技術(shù))和光譜法兩大類[4]。前者存在制樣耗時(shí)、繁瑣、分析成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)[5]等眾所周知的弱點(diǎn)。此外，色譜法測(cè)定脂肪酸甘油酯[6]、不皂化物等特征物質(zhì)[7]，需要采用不同制樣方法、不同色譜條件，分析成本與檢測(cè)周期更難把握，因此這類技術(shù)難以滿足市場(chǎng)監(jiān)管要求[8]。光譜技術(shù)制樣簡(jiǎn)單、分析周期短，其中紅外光譜更以分析速度快、分析成本低且能獲取豐富的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息，成為光譜方法中研究熱門[9-10]。但光譜方法通常特異性、敏感性不如色譜法[11]。近年來迅猛發(fā)展的紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合[12-13]的方法，提高了光譜信息提取能力。盡管如此，這種結(jié)合目前都是基于植物油紅外光譜數(shù)據(jù)，提取了植物油主成分脂肪酸甘油酯信息但未有效提取植物油另一類特征物質(zhì)微量成分不皂化物的信息，所構(gòu)建的植物油鑒定/摻假植物油篩查模型，對(duì)于摻入與目標(biāo)植物油主成分差異大的摻雜植物油，模型能很好地鑒別[8]，如加入棕櫚油的摻假花生油，加入大豆油的摻假橄欖油等；而對(duì)于摻入與目標(biāo)植物主成分差異小的摻雜植物油[14]，則鑒別效果差，如加入玉米油的摻假芝麻油，加入玉米油或大豆油的摻假花生油等。因此，目前紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合所構(gòu)建的植物油鑒定/摻假植物油篩查模型的敏感性仍有待提高。不皂化物特征性強(qiáng)[3]，其測(cè)定都是基于色譜法[15-16]。由于植物油中不皂化物含量低，為了有效獲取它們的紅外光譜信息，首先需要對(duì)其進(jìn)行分離富集。目前的方法是采用回流加熱皂化、有機(jī)溶劑多次提取、反復(fù)水洗除有機(jī)相堿性物質(zhì)、最后除有機(jī)相中水，整個(gè)過程操作非常繁瑣，耗時(shí)(約2～3 h)。這種方法基本無法應(yīng)用于批量樣品，這也是至今未見基于不皂化物紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行植物油鑒定/摻假植物油篩查的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的重要原因。本研究從以下策略著手：①提高植物油皂化反應(yīng)速度；②設(shè)計(jì)合理溶劑比例、簡(jiǎn)化不皂化物提取步驟；③建立有機(jī)相快速除皂、除水技術(shù)，發(fā)展快速、方便的植物油不皂化物分離富集方法，為有效獲取批量植物油不皂化物紅外光譜信息，全面分析植物油各類物質(zhì)紅外光譜，構(gòu)建高敏感性高特異性的快速植物油鑒定/摻假植物油篩查方法奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

IS5傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾)；ATR-ID7附件；P210超聲儀(Elma)。

6 mL solid phase extraction(SPE)小柱塑料管及篩板購(gòu)自Agilent公司。3A分子篩(Ф=1 mm)購(gòu)自鄭州天祥無機(jī)材料有限公司。95%乙醇、正己烷、氫氧化鉀均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5種品牌芝麻油和5種品牌玉米油均購(gòu)于大型超市。

1.2 方法

1.2.1 紅外光譜采集

波數(shù)范圍3 100～670 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32，植物油、不皂化物直接涂抹在ATR-ID7金剛石晶體表面，采集的紅外光譜通過OMNIC軟件，經(jīng)自動(dòng)基線校正、縱坐標(biāo)歸一化后保存。光譜采集后，晶體用正己烷清洗兩次，然后用丙酮清洗，并用軟布擦干，再涂抹下一個(gè)樣品。

1.2.2 溶液配制

2 mol·L-1氫氧化鉀乙醇溶液(皂化液)：稱取一定量氫氧化鉀，用少量去離子水溶解，轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。

乙醇水溶液：10%(V/V)乙醇水溶液。

1.2.3 皂化條件研究

為了加快皂化反應(yīng)速度縮短皂化時(shí)間，本研究改用超聲加熱代替回流加熱。稱取2 g玉米油樣于45 mL具塞樣品瓶中，添加30 mL皂化液，渦旋震蕩30 sec。對(duì)以下關(guān)鍵皂化條件進(jìn)行優(yōu)化：(1)超聲儀在sweep模式下，通過合理搭配頻率(frequency)與能量(power)參數(shù)進(jìn)行兩個(gè)參數(shù)的優(yōu)化；(2)確定超聲儀頻率與能量后，進(jìn)行最佳皂化溫度研究；(3)基于前面兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行最佳皂化時(shí)間研究。不皂化物提取采用國(guó)標(biāo)法[17]，趕盡不皂化物溶液中溶劑(60 ℃水浴)，采集不皂化物紅外光譜。

1.2.4 快速提取不皂化物

為縮短不皂化物提取時(shí)間進(jìn)行了如下研究：

(1)基于1.2.2的研究結(jié)果(見2.1)，在最佳皂化條件下皂化玉米油，皂化結(jié)束后加入35 mL去離子水混勻，研究15 mL正己烷一次及多次提取不皂化物，依據(jù)國(guó)標(biāo)法除去有機(jī)相中堿性物質(zhì)及水，趕盡溶劑(60 ℃水浴)，采集不皂化物紅外光譜，研究正己烷提取次數(shù)對(duì)不皂化物紅外光譜的影響。

(2)其他操作同本節(jié)(1)，分別加入10，15和20 mL正己烷提取不皂化物一次，研究不同體積正己烷提取不皂化物對(duì)其紅外光譜的影響。

(3)專用SPE小柱(6 mL，帶下篩板，下層填充約1/3柱體積的無水硫酸鈉，上層填充約1/3柱體積的3A分子篩)，稱取兩份玉米油樣，在最佳皂化條件下皂化，皂化結(jié)束后加入35 mL去離子水混勻，再加入15 mL正己烷提取不皂化物一次，吸取5 mL有機(jī)相，過專用SPE小柱同時(shí)除去有機(jī)相中堿性物質(zhì)及水，收集流出物于25 mL蒸發(fā)皿中，趕盡溶劑(60 ℃水浴)，采集不皂化物紅外光譜；另1份其他條件相同但采用國(guó)標(biāo)法除有機(jī)相中堿性物質(zhì)及水。

1.2.5 快速分離富集不皂化物方法穩(wěn)定性

依據(jù)1.2.2和1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取4份玉米油樣，由不同人員分別按以下步驟完成不皂化物分離富集：每份油樣添加30 mL皂化液，渦旋震蕩0.5 min，在超聲器37 Hz和70% power、皂化溫度55 ℃條件下，超聲10 min,加入35 mL去離子水混勻，再加15 mL正己烷提取不皂化物一次，吸取5 mL有機(jī)相，過專用SPE小柱，用25 mL蒸發(fā)皿收集流出液，趕盡溶劑，采集4份不皂化物紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳皂化條件

提高皂化液堿度有利于皂化反應(yīng)，因此將皂化液堿度從國(guó)標(biāo)法的1 mol·L-1氫氧化鉀乙醇溶液提高至2 mol·L-1。①超聲頻率frequency及能量power的選擇：在55 ℃、10 min超聲條件下，探索37 Hz,80 Hz，30% power，70% power和100% power參數(shù)的各種搭配，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在sweep模式下，超聲頻率(frequency)37 Hz，能量(power)70%時(shí)，不皂化物紅外光譜中表征脂肪酸甘油酯的特征吸收峰1748 cm-1峰強(qiáng)最小，該條件下皂化效率最高，因此選擇該條件皂化。②皂化溫度的選擇：分別在45，50，55和60 ℃皂化溫度下超聲15 min，皂化溫度為50 ℃時(shí)，1 748 cm-1處只有一個(gè)很小的吸收峰，55 ℃時(shí)1 748 cm-1吸收峰消失，60 ℃時(shí)雖然沒有1 748 cm-1吸收峰,但在1 728 cm-1處出現(xiàn)微小吸收峰，1 728 cm-1可能是溫度太高部分雙鍵氧化，形成的酮或醛的羰基吸收峰，因此選擇55 ℃作為皂化溫度。③皂化時(shí)間的選擇：超聲皂化時(shí)間分別為5，10和15 min，時(shí)間為10和15 min時(shí)1 748 cm-1吸收峰消失，因此皂化時(shí)間選10 min。最終優(yōu)化的皂化條件是：在sweep模式下，頻率frequency 37 Hz，能量power 70%，皂化溫度55 ℃，皂化時(shí)間10 min。目前回流加熱皂化法需要近1～2 h才能將植物油完全皂化，本研究新建的皂化法只要10 min，大大縮短了皂化時(shí)間。

2.2 快速提取不皂化物

國(guó)標(biāo)法提取不皂化物時(shí)體系易乳化，等待分層時(shí)間長(zhǎng)。體系易乳化與體系組成成分有關(guān)，可以通過改變體系的主要成分正己烷，乙醇和水的比例加以改善。本研究通過大量實(shí)驗(yàn)得出：2 g植物油樣，添加30 mL皂化液，按2.1優(yōu)化的條件皂化，皂化結(jié)束后添加35 mL去離子水混勻，再加15 mL正己烷提取不皂化物(具體的比例調(diào)節(jié)過程不在此處贅述)，這種體系正己烷，乙醇和水的比例可以克服體系易乳化的缺點(diǎn)，兩相分層快，提取時(shí)間大大縮短。

紅外光譜分析不皂化物，變量是吸收峰位置及其相對(duì)強(qiáng)度，關(guān)鍵要素是不皂化物成分構(gòu)成及各成分相對(duì)含量而不是絕對(duì)含量。因此，只要機(jī)溶劑一次提取與多次提取的紅外光譜基本相同，可將國(guó)標(biāo)法的3次提取改為1次提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：15 mL正己烷一次、分二次、分三次提取，獲取的不皂化物紅外光譜基本相同。用10，15和20 mL正己烷提取，得到的不皂化物紅外光譜也基本相同。因此不皂化物提取步驟簡(jiǎn)化為采用15 mL正己烷提取一次。

國(guó)標(biāo)法需要用乙醇水溶液多次清洗有機(jī)相去除其中殘余堿性物質(zhì)，通常至少經(jīng)過三次清洗，pH值才能達(dá)到中性，最后還需用無水硫酸鈉除去有機(jī)相中殘余水，這個(gè)過程時(shí)間長(zhǎng)且操作繁瑣。無水硫酸鈉吸水效率不夠高，經(jīng)篩選、測(cè)試各種除水劑，發(fā)現(xiàn)3A分子篩吸水效率高，而且有機(jī)相通過3A分子篩后pH值就達(dá)到中性。因此專用SPE小柱選擇3A分子篩和無水硫酸鈉作為填充劑，其中下層的無水硫酸鈉主要用于防止3A分子篩細(xì)粉流出，干擾不皂化物紅外光譜。有機(jī)相中殘余堿性物質(zhì)主要是皂，有機(jī)相通過專用SPE小柱時(shí)水含量迅速降低，皂析出被柱內(nèi)吸附劑阻止流出，這可能是3A分子篩能夠除皂的原因。使用這種新研制的專用SPE小柱，能快速一次性去除有機(jī)相中殘留堿性物質(zhì)和水，大大縮短提取時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟。圖1為采用專用SPE小柱及國(guó)標(biāo)法除有機(jī)相堿、水后，不皂化物紅外光譜，由圖1可知，兩種方法得到的不皂化物，它們的紅外光譜相同，都不存在皂的紅外特征吸收峰1 580 cm-1和水的紅外特征吸收峰1 640 cm-1，表明專用SPE小柱可以一次性除去有機(jī)相中殘余的堿性物質(zhì)和水而且小柱不吸附不皂化物。

圖1 分別用SPE法及國(guó)標(biāo)法除堿性物質(zhì)和水后，玉米油不皂化物紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of unsaponifiables of corn oil after removing alkaline substance and water by SPE and national standard method respectively

通過上述改進(jìn)，不皂化物的提取時(shí)間從國(guó)標(biāo)法的約1 h縮短至10 min。

2.3 方法穩(wěn)定性研究

用新建植物油不皂化分離富集方法，同一玉米油樣品不同人員分別制樣，獲得的不皂化物A-1，A-2，B-1和B-2紅外光譜如圖2。

圖2 同一玉米油樣品，兩人四次制樣采集的玉米油不皂化物紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of unsaponifiables from same corn oil sample through two persons four times sample preparation

圖2表明四次制樣得到的玉米油不皂化物紅外光譜譜圖相同，說明新建的植物油不皂化物分離富集方法有很好的穩(wěn)定性，可以保證一個(gè)樣品一種譜圖。

2.4 玉米油、芝麻油紅外光譜及其不皂化物紅外光譜

圖3是五個(gè)牌號(hào)玉米油與五個(gè)牌號(hào)芝麻油紅外光譜圖，由圖3可知兩種植物油的紅外光譜幾乎完全相同。采用本文建立的植物油不皂化物快速分離富集法，獲取兩種植物油不皂化物，采集上述五個(gè)牌號(hào)玉米油與五個(gè)牌號(hào)芝麻油的不皂化物紅外光譜，它們的譜圖如圖4。由圖4可知，紅外光譜幾乎完全相同的玉米油與芝麻油，其不皂化物的紅外光譜有很大差異。因此，在現(xiàn)有的植物油紅外光譜數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上添加經(jīng)分離、富集獲取的不皂化物紅外光譜數(shù)據(jù)，有望大大提高紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合建立植物油鑒定/摻偽植物油篩查方法的敏感性。

圖3 五個(gè)牌號(hào)的玉米油(上)與五個(gè)牌號(hào)的芝麻油(下)紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of five brands of corn oil (top) and five brands of sesame oil (bottom)

圖4 五個(gè)牌號(hào)的玉米油不皂化物(上)與五個(gè)牌號(hào)的芝麻油不皂化物(下)紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of unsaponifiables of five brands of corn oil (top) and five brands of sesame oil (bottom)

3 結(jié) 論

采用增加皂化液堿度、超聲加熱皂化的方法可提高植物油皂化效率，縮短皂化時(shí)間。在提高植物油皂化效率的基礎(chǔ)上，通過①合理配置正己烷、乙醇及水的比例形成易分層體系；②將有機(jī)溶劑多次提取改為一次提??；③采用首次研制的專用SPE小柱，一次性快速去除有機(jī)相中殘余堿性物質(zhì)和水，進(jìn)一步縮短不皂化物提取時(shí)間。不皂化物分離富集時(shí)間從國(guó)標(biāo)法的約2～3 h縮短至約20 min，新建的不皂化物分離富集方法有很好的穩(wěn)定性，同一樣本不同人員分別制樣，得到的不皂化物紅外光譜相同，可以保證一個(gè)樣品一種紅外光譜。采用本研究所建立的植物油不皂化物快速分離富集方法，提取五個(gè)不同品牌的芝麻油和五個(gè)不同品牌玉米油不皂化物并采集它們的紅外光譜，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：紅外光譜幾乎完全相同的芝麻油與玉米油其不皂化物紅外光譜有非常大的差異。不皂化物紅外光譜特征性強(qiáng)，與植物油紅外光譜有互補(bǔ)性，可以預(yù)測(cè)在植物油紅外光譜的基礎(chǔ)上結(jié)合其不皂化物紅外光譜數(shù)據(jù)，可以大大提高某些植物油(如芝麻油)鑒定方法的敏感性。本工作將進(jìn)一步開展各類植物油不皂化物紅外光譜研究，建立基于植物油不皂化物紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合的快速植物油鑒定/摻假植物油篩查方法。