文鑫鑫，楊 鑫

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000)

貴州益佰制藥的獨(dú)家產(chǎn)品克咳膠囊處方中包括以下藥材：麻黃、罌粟殼、甘草等。以上藥材經(jīng)過酸水煎煮、濃縮浸膏、與細(xì)粉混勻等工藝精制而成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，臨床用于咳嗽、喘急氣粗。處方中的罌粟殼的主要有效成分為生物堿嗎啡，具有成癮性?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3215-98收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十七冊(cè)[1]，其先行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定項(xiàng)，質(zhì)量可控性差，無法滿足生產(chǎn)質(zhì)控要求。本次實(shí)驗(yàn)首次以嗎啡為檢測(cè)指標(biāo)對(duì)克咳膠囊建立高效液相色譜法測(cè)定含量，測(cè)定15批次止咳膠囊嗎啡含量，擬定合理限度范圍。按照《中國藥典》2020版四部通則[2]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法操作簡單快速，精密度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠有效控制止咳膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量。為止咳膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測(cè)器，工作站(Empower3)；梅特勒XPE205，XPR36電子天平；SK8200HP型數(shù)控超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、磷酸(重慶川東化工)，1-庚烷磺酸鈉(廣東翁江試劑)，磷酸二氫鉀(天津科密歐試劑)均為分析純?cè)噭┰囁?，乙腈為Fisher色譜純；嗎啡對(duì)照品購于中檢院，批號(hào)為171201-201825，供HPLC含量測(cè)定時(shí)含量為93.6%)，15批樣品及缺罌粟殼的陰性樣品由貴州益佰制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

以辛烷基鍵合硅膠柱為分析色譜柱，本實(shí)驗(yàn)選用Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液進(jìn)行等量混合(用磷酸溶液調(diào)pH至2.8)87 mL與乙腈13 mL混合；210 nm檢測(cè)；進(jìn)樣10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取供試品10粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱取約0.5 g，置25 mL容量瓶中，加含5%醋酸的20%甲醇溶液約15 mL，搖勻，超聲處理30 min(53 kHz，500 W)，放冷至室溫，用含5%醋酸的20%甲醇溶液稀釋到刻度，搖勻，離心，過濾即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取嗎啡對(duì)照品適量，加“2.3”項(xiàng)下溶劑溶解并稀釋制成最終濃度為每1 mL約含38 μg嗎啡的溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

取由貴州益佰制藥制備的缺罌粟殼的陰性樣品按照“2.2”項(xiàng)下方法制備即得。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取上述三種溶液，按照“2.1”項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果見圖1，表明本方法專屬性良好，嗎啡出峰處無其他峰干擾。

圖1 專屬性色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取嗎啡適量(5.232 mg)，置50 mL量瓶中，加“2.2”項(xiàng)下溶劑溶解并稀釋至刻度，制得嗎啡對(duì)照品貯備液(0.097943 mg/mL)。吸取該儲(chǔ)備溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至10 mL容量瓶，用上面相同的溶劑稀釋至刻度即得。按照“2.1”項(xiàng)下測(cè)定，以峰面積A為縱坐標(biāo)，嗎啡濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，線性范圍為9.7943～58.7658 μg/mL，線性回歸方程為：

A=47793.61674C-894.57560，R2=0.99993

將第二點(diǎn)及最后一點(diǎn)的峰面積代入上述回歸方程所得濃度與配制濃度相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.00545、0.22%，均相當(dāng)小，故可認(rèn)為過原點(diǎn)?？捎猛鈽?biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行含量測(cè)定計(jì)算。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液(濃度為0.039177 mg/mL)，吸取10 μL按照“2.1”下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，嗎啡的平均峰面積RSD為0.26%(遠(yuǎn)小于2.0%)，說明精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取克咳膠囊(批號(hào)：210212)約0.5 g各6份，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按照“2.2”項(xiàng)下方法平行制備得到供試品溶液6份，在“2.1”條件測(cè)定，得到6份的平均值為0.505 mg/粒，RSD為1.34%(小于2.0%)，說明重復(fù)性符合要求。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的樣品(該批次樣品嗎啡含量為1.16 mg/g)0.25 g，置25 mL容量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液(嗎啡為0.2109 mg/mL)2 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，吸取10 μL在“2.1”條件下進(jìn)行測(cè)定，6份回收率平均值為100.9%，RSD為0.57%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.8項(xiàng)下的供試品溶液，分別于0 h、1 h、2 h、8 h、16 h、32 h、48 h進(jìn)樣測(cè)定嗎啡峰面積，RSD為0.16%，說明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性試驗(yàn)

取同一份對(duì)照和供試品溶液在不同儀器不同柱子上進(jìn)行考察：柱子1：色譜柱，Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用儀器：Waters e2695高效液相色譜儀。柱子2：資生堂色譜柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，儀器：賽默飛U3000高效液相色譜儀。柱子3：普寧科技色譜柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀，結(jié)果RSD為1.86%，說明該方法耐用性好。

2.12 樣品測(cè)定

取15批克咳膠囊，按《中國藥典》2020版四部通則得到平均裝量，按上述方法制備供試品溶液及測(cè)定，結(jié)果15批樣品平均含量為0.516 mg/粒。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

吸取對(duì)照和供試品溶液分別注入液相色譜儀，按照上述條件測(cè)定。結(jié)果表明：對(duì)照品嗎啡峰的光譜圖與供試品中嗎啡峰的光譜掃描圖基本一致。對(duì)照品與供試品嗎啡峰的掃描圖均在209.6 nm處有最大吸收，且兩者峰形也幾乎一致，并且達(dá)到純度要求。

3.2 提取方法選擇

嘗試3種提取方式，分別是方法1：用氨水飽和的氯仿提取，水浴蒸干，甲醇溶解；方法2：含5%醋酸的20%甲醇溶劑超聲30 min提取[2]；方法3：含5%醋酸的20%甲醇溶劑水浴回流提取1 h；結(jié)果方法1含量0.163 mg/粒，方法2含量0.511 mg/粒，方法3含量為0.524。方法2和方法3含量差不多，但是方法2簡單、易操作，故采用方法2。

3.3 流動(dòng)相及色譜柱的確定

嗎啡等生物堿類物質(zhì)為了能夠使其在色譜柱中保留更好，流動(dòng)相一般要加入離子對(duì)試劑，故嗎啡HPLC含量測(cè)定的流動(dòng)相從以下3種選擇[3]：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液等量混合(磷酸溶液調(diào)pH至2.8)87 mL與乙腈13 mL混合，乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉-0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶(20∶40∶40)，乙腈-0.1%磷酸(12∶88)(含0.1%庚烷磺酸鈉)[3]等，經(jīng)過摸索，3種流動(dòng)相比例樣品的分離效果都可以，第一種流動(dòng)相比例下嗎啡峰保留時(shí)間合適(14 min左右)，色譜峰形好，對(duì)稱因子合適(0.95～1.05)，故選第一種流動(dòng)相。

3.4 小結(jié)

處方中的罌粟殼所含有效成分嗎啡是止咳的有效成分，但是具有成癮性，該方法操作簡便，節(jié)約了提取溶劑消耗，加快了提取時(shí)間，方法重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于克咳膠囊中嗎啡含量的測(cè)定。