鮑 慧 孫曉東 喬 健 賀 晶

宮頸癌是原發(fā)于子宮頸部的惡性腫瘤。全球范圍內(nèi)，宮頸癌年齡標(biāo)準化發(fā)病率為13.1/10萬，年齡標(biāo)準化死亡率為6.9/10萬，嚴重影響婦女健康[1]。目前宮頸癌治療手段包含靶向藥物治療以及以手術(shù)為主并輔以放、化療的治療，雖然具有一定療效，但存在很大局限性以及毒副作用，而基因治療已成為當(dāng)今腫瘤治療研究的熱點[2]。長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)和微小RNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。XIST是具有廣泛生物學(xué)作用的LncRNA，參與結(jié)直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程[3，4]； miR-132-3p在套細胞淋巴瘤等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程也發(fā)揮重要功能[5]；已有研究報道XIST可促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[6]。然而miR-132-3p在宮頸癌中發(fā)揮的功能未知。有研究發(fā)現(xiàn)XIST可靶向miR-132-3p調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展[7]，但XIST能否通過靶向miR-132-3p調(diào)控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移尚未可知。有研究發(fā)現(xiàn)miR-132-3p可通過靶向性別決定因子同源盒4(SOX4)調(diào)控肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[8]；且已有報道指出SOX4可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)節(jié)宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移[9]。LncRNA XIST能否通過靶向miR-132-3p調(diào)控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移未知。鑒于此，本研究選取人宮頸癌細胞株Hela進行體外細胞實驗，探究XIST對調(diào)控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞和試劑：人宮頸癌細胞株Hela(購自歐洲標(biāo)準細胞收藏中心，批號EC-0101)；脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染試劑盒(購自美國英杰生命技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號11668-019)；干擾-XIST(si-XIST，合成序列：5’-AAA GCU AAG AUA AAU GGA AGA-3’)質(zhì)粒、干擾-對照(si-NC，合成序列：5’-UGC CCA GGA AGU UAC CUU AAG-3’)質(zhì)粒、過表達-XIST(pcDNA3.1-XIST，合成序列：正義鏈5’-AAC CAA AUC AAA GAU GUC CGG-3’，反義鏈5’-CAA GUA AGG UUC CGG CAU UCU-3’)質(zhì)粒、pcDNA3.1-XIST對照(pcDNA3.1-control，合成序列：正義鏈5’-AGC AGG UGC GGG UUA GAA GGU-3’，反義鏈5’-UAA ACC AAG CGU AUC UGU CCA-3’)質(zhì)粒、野生型和突變型XIST報告基因質(zhì)粒(野生型pGLO-XIST和突變型pGLO-XIST)、野生型和突變型SOX4報告基因質(zhì)粒(野生型pGLO-SOX4和突變型pGLO-SOX4)(由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成)；甲基噻唑藍(MTT)溶液(購自北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號M1025)；侵襲小室(Transwell，孔徑5μm)、基質(zhì)膠(購自美國康寧公司，生產(chǎn)批號3422、354277)；結(jié)晶紫染色液(購自上海復(fù)申生物科技有限公司，生產(chǎn)批號FS0466)；總RNA提取試劑(購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號NR0002)；XIST、miR-132-3p、SOX4、細胞增殖抗原標(biāo)記物(Ki-67)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、U6、β-肌動蛋白(β-actin)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限公司合成)；鼠抗人SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、β-actin單克隆抗體(一抗)，兔抗鼠SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、β-actin辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體(二抗)(購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號H00006659-A01、NBP2-22112、2926P、ab228022、ab8978、12015-01、BM3501-01；PAB14638、BS1454、BS2436、C1817、3932S、BS1236、LS-C212187)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(購自上海李記生物科技有限公司，生產(chǎn)批號AC19L022)。

1.1.2 儀器：AE31型熒光顯微鏡(購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；Gemini EM型酶標(biāo)儀[購自美谷分子儀器(上海)有限公司]；IX83型倒置顯微鏡(購自日本奧林巴斯)；M402118型核酸蛋白檢測儀(購自北京海富達科技有限公司)；7500型PCR儀(購自美國ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將人宮頸癌細胞株Hela接種至含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的杜氏培養(yǎng)液(DMEM)中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染和分組：待細胞生長至對數(shù)期時接種至24孔板培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達到85%時，參照Lipofectamine 2000說明書分別將si-XIST、si-NC、pcDNA3.1-XIST、pcDNA3.1-control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人宮頸癌細胞株Hela，分別記為XIST下調(diào)組、下調(diào)對照組、XIST上調(diào)組、上調(diào)對照組，轉(zhuǎn)染成功細胞呈綠色熒光。XIST下調(diào)組、下調(diào)對照組、XIST上調(diào)組、上調(diào)對照組轉(zhuǎn)染效率分別為(89.64±16.92)%、(84.07±15.14)%、(80.14±14.08)%、(83.79±15.78)%。見圖1。另取未處理人宮頸癌細胞株Hela，記為空白組。每組設(shè)6個復(fù)孔。

圖1 各組細胞轉(zhuǎn)染效率(熒光顯微鏡，×100，刻度尺：100μm)

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖活性：轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細胞，調(diào)整細胞密度為5×103個/ml，接種至96孔板(100μl/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)48h，加入MTT溶液(20μl/孔)，混勻避光孵育4h，棄上清，加二甲基亞砜(150μl/孔)，混勻后置于酶標(biāo)儀檢測波長490nm處光密度值。各組細胞增殖抑制率=(空白組光密度值-實驗組光密度值)/空白組光密度值×100.00%。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力：轉(zhuǎn)染48h后收集各組細胞，胰酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，向預(yù)先用基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室加150μl細胞懸液，下室加含血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24h；磷酸鹽緩沖液淋洗，小心擦去微孔膜內(nèi)層細胞，乙醇固定5min，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡計數(shù)穿膜細胞數(shù)，每組隨機選取5個視野，取平均值。檢測細胞遷移能力時，小室上室無需基質(zhì)膠包被基底膜，其余步驟與細胞侵襲能力檢測方法相同。

1.2.5 實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達：轉(zhuǎn)染48h后，參照總RNA提取試劑說明提取各組細胞總RNA，核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，稀釋RNA濃度為40μg/ml。逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸后用PCR儀進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，40個循環(huán)。引物序列見表1。采用2-△△Ct法[10]計算待測基因相對表達量。其中選取U6為miR-132-3p內(nèi)參基因，β-actin為其余基因的內(nèi)參基因。

表1 PCR引物序列

1.2.6 免疫印跡法(WB)檢測細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達：轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細胞，加入細胞裂解液，獲取各組細胞蛋白質(zhì)。BCA法定量蛋白，蛋白樣品以4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)4℃孵育，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋倍數(shù)為1∶5 000)，室溫孵育1h，顯色反應(yīng)，分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值即為該蛋白相對表達量。

1.2.7 LncRNA XIST靶向調(diào)控miR-132-3p驗證：應(yīng)用生物信息學(xué)軟件StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測LncRNA XIST的miRNA結(jié)合位點。分別將野生型XIST、突變型XIST與miR-132-3p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至人宮頸癌細胞株Hela，嚴格按照試劑盒說明書應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-132-3p mimic組和miR-NC組中XIST相對熒光強度，相對熒光強度=螢火蟲熒光素酶熒光強度/海腎熒光素酶熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較

各組細胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白組、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組比較，XIST下調(diào)組細胞增殖抑制率上升(t均>13.21，P<0.01)，XIST上調(diào)組細胞增殖抑制率下降(t均>13.21，P<0.01)；與XIST下調(diào)組比較，XIST上調(diào)組細胞增殖抑制率下降(t=18.96，P<0.01)，空白組、下調(diào)對照組、上調(diào)對照組間細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t均=0，P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較

2.2 各組細胞侵襲、遷移能力比較

各組細胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白組、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組比較，XIST下調(diào)組細胞侵襲和遷移數(shù)目均減少(t均>3.24，P<0.01)，XIST上調(diào)組細胞侵襲和遷移數(shù)目增多(t均>3.07，P<0.05或P<0.01)；與XIST下調(diào)組比較，XIST上調(diào)組細胞侵襲和遷移數(shù)目增多(t均>9.24，P<0.01)，空白組、下調(diào)對照組、上調(diào)對照組間細胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t均<0.86，P>0.05)。見圖2、3和表3。

圖2 各組細胞侵襲能力變化(結(jié)晶紫染色，×200，刻度尺：30μm)

圖3 各組細胞遷移能力變化(結(jié)晶紫染色，×200，刻度尺：30μm)

表3 各組細胞侵襲、遷移數(shù)目(個，

2.3 各組細胞XIST、miR-132-3p水平及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達比較

各組細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白組、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組比較，XIST下調(diào)組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達下降、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>2.32，P<0.05或P<0.01)，XIST上調(diào)組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達升高、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>2.02，P<0.05或P<0.01)；與XIST下調(diào)組比較，XIST上調(diào)組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達上升、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>2.08，P<0.05或P<0.01)?？瞻捉M、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t均<0.71，P>0.05)。見表4。

2.4 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達比較

各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白組、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組比較，XIST下調(diào)組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達下降、E-cadherin蛋白表達上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>5.46，P<0.01)，XIST上調(diào)組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達上升、E-cadherin蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>7.64，P<0.01)；與XIST下調(diào)組比較，XIST上調(diào)組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達上升、E-cadherin蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>10.20，P<0.01)?？瞻捉M、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組各蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t均<0.01，P>0.05)。見圖4、表5。

表4 各組細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達

表5 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達

圖4 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(WB)

2.5 LncRNA XIST靶向調(diào)控miR-132-3p

生物信息學(xué)軟件StarBase預(yù)測XIST與miR-132-3p存在相似結(jié)合位點，見圖5。在轉(zhuǎn)染野生型XIST細胞中，miR-132-3p mimic組細胞相對熒光強度低于miR-NC組細胞(t=4.58，P<0.05)；在轉(zhuǎn)染突變型XIST細胞中，miR-132-3p mimic組細胞相對熒光強度與miR-NC組細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.31，P>0.05)，見圖6。

圖5 XIST與miR-132-3p潛在結(jié)合位點

注：與野生型XISTmiR-NC組比較，*P<0.05

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與空白組、下調(diào)對照組和上調(diào)對照組比較，XIST下調(diào)組細胞增殖抑制率上升、細胞侵襲和遷移數(shù)目減少，XIST上調(diào)組細胞增殖抑制率下降、細胞侵襲和遷移數(shù)目增多。以上結(jié)果顯示，XIST在宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移過程發(fā)揮促進作用，miR-132-3p在宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移過程發(fā)揮抑制作用。

本研究結(jié)果表明XIST過表達可增強人宮頸癌細胞株的增殖、侵襲與遷移能力，而低表達可降低其增殖、侵襲與遷移能力，表明調(diào)控LncRNA XIST可影響人宮頸癌細胞株的惡性生物學(xué)行為。EMT與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程密切相關(guān)，有報道表明XIST可通過靶向miR-133a調(diào)控SOX4調(diào)節(jié)EMT過程從而調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[11]。有研究指出miR-132-3p可直接靶向SOX4促進骨肉瘤細胞增殖[12]。LncRNA XIST參與惡性腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲的作用途徑包括影響細胞周期、調(diào)控MMP-2和MMP表達等。另有研究顯示[13]，LncRNA XIST表達與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤等均有關(guān)，且其高表達能夠增加復(fù)發(fā)率、縮短無進展生存期和總生存期。由此可知LncRNA XIST可參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。據(jù)此推測，XIST和miR-132-3p可能通過靶向SOX4調(diào)控EMT過程從而調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究還顯示，XIST過表達可促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin和miR-132-3p表達；miR-132-3p沉默表達可促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin表達。以往研究顯示XIST在不同腫瘤中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)功能，袁甫軍等[14]指出XIST可抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抑癌作用；周明龍等[15]發(fā)現(xiàn)抑制XIST 可抑制CyclinD1，抑制肝癌細胞增殖；徐倩等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑制XIST表達，可抑制MMP-2表達，抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力，發(fā)揮促癌作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示miR-132-3p mimic可抑制野生型XIST質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞相對熒光強度，但對突變型XIST質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞無影響，證明XIST可直接靶向調(diào)控miR-132-3p。miR-132-3p在不同腫瘤中也發(fā)揮不同調(diào)節(jié)功能，Wang 等[17]指出miR-132-3p在非小細胞肺癌中處于高表達狀態(tài)，過表達miR-132-3p可促進非小細胞肺癌細胞增殖，發(fā)揮促癌作用；牛文惠等[18]指出miR-132-3p可通過靶向SOX4抑制EMT發(fā)生過程，調(diào)控E-cadherin和Vimentin表達，調(diào)節(jié)耐藥細胞的增殖、侵襲和遷移能力；Zhao等[19]指出SOX4可調(diào)控 Ki-67、Cyclin D1、MMP-2表達，調(diào)節(jié)黑色素瘤的增殖與侵襲；He等[20]指出SOX4通過調(diào)控Ki-67、CyclinD1表達，提高急性髓性白血病細胞的增殖能力；Meng等[21]指出SOX4可調(diào)控E-cadherin和Vimentin表達，調(diào)節(jié)宮頸癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與上述肝癌、黑色素瘤、急性髓性白血病研究結(jié)果相同，與乳腺癌、非小細胞肺研究結(jié)果相反，可能與XIST和miR-132-3p功能具有多向性，在不同腫瘤環(huán)境發(fā)揮不同功能相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)XIST可直接靶向miR-132-3p加重急性肺損傷[22]，同時也有研究指出了miR-132-3p對SOX4的靶向作用[23]，本研究與兩者研究結(jié)果一致，證實了XIST對miR-132-3p的直接靶向作用。

綜上所述，XIST可能通過靶向調(diào)控miR-132-3p表達，促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin表達，發(fā)揮促癌作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中miR-132-3p發(fā)揮抑癌功能以及XIST對miR-132-3p直接靶向作用，提示XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點，有助于指導(dǎo)宮頸癌靶向治療研究，具有創(chuàng)新性和重要意義，同時也有望減輕宮頸癌患者的痛苦、延長其生存期。

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本文第一作者簡介：

鮑 慧(1982-)，女，漢族，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤