計(jì) 銳， 鄭君芳

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬同仁醫(yī)院本?？平逃?，北京市100176；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究實(shí)驗(yàn)室，北京市100069)

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladeno-sine,m6A)修飾是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾，往往含有一段保守基序RRACH(R代表A或G，H代表A、C或U)，它是真核生物RNA最常見(jiàn)的一種表觀修飾方式，存在于各種不同類型的RNA上，包括信使RNA(mRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(Micro RNA，miRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等[1]。m6A修飾是一種由多種蛋白維持的動(dòng)態(tài)、可逆平衡過(guò)程，包括甲基轉(zhuǎn)移酶，去甲基化酶以及閱讀蛋白等。m6A甲基化修飾參與調(diào)控mRNA的剪切加工、核轉(zhuǎn)運(yùn)、降解及翻譯等過(guò)程，在mRNA的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái)，m6A甲基化修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到重視，但m6A甲基化修飾與泌尿系統(tǒng)腫瘤中的研究并不多見(jiàn)。本文就m6A甲基化修飾的生理作用機(jī)制及其與泌尿系統(tǒng)腫瘤之間的關(guān)系做一綜述。

1 m6A甲基化修飾的3種蛋白

1.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基介導(dǎo)RNA發(fā)生甲基化修飾，主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like14，METTL14)及其輔助因子腎母細(xì)胞瘤1-相關(guān)蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein,WTAP)等組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，此外，還包括METTL3的同源物甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(methyltransferase-like 16，METTL16)、病毒分離劑類m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(virus isolator m6A methyltransferase-associated proteins，VIRMA，也稱KIAA14929)、RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RNA-binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)和含鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)13(protein containing zinc finger CCCH domain 13，ZC3H13)等其他蛋白質(zhì)[2]。Wang等[3]發(fā)現(xiàn)，METTL3是一種催化活性甲基轉(zhuǎn)移酶，METTL14在其活性位點(diǎn)提供結(jié)構(gòu)支持以實(shí)現(xiàn)催化作用。RNA GAC和AAC甲基化由METTL3選擇性誘導(dǎo)，而METTL14選擇性誘導(dǎo)RNA GAC甲基化，二者協(xié)同介導(dǎo)m6A甲基化過(guò)程。METTL3和METTL14形成異二聚體，WTAP通過(guò)募集METTL3和METTL14來(lái)促進(jìn)m6A甲基化進(jìn)程[4]。VIRMA往往優(yōu)先選中3′-UTR附近的mRNA來(lái)介導(dǎo)甲基化，ZC3H13與WTAP等其他輔助因子共同作用控制m6A甲基化過(guò)程[5]。

1.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶的作用是對(duì)已經(jīng)發(fā)生m6A修飾的堿基去除甲基化修飾，肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated,FTO)基因和α-酮戊二酸依賴的加雙氧酶ALKB同源蛋白5(α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)均屬此類。FTO和ALKBH5以Fe(II)和α-酮戊二酸依賴性的方式催化m6A的去甲基化，他們均為α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族成員[6]。m6A的去甲基化依賴FTO的氧化功能，生理?xiàng)l件下，m6A是FTO的最佳底物。m6A修飾在m6A去甲基化酶與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用下，成為一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆且相對(duì)平衡的過(guò)程。

1.3 m6A閱讀蛋白

m6A閱讀蛋白主要作用是識(shí)別發(fā)生m6A修飾的堿基，進(jìn)而指導(dǎo)下游生物活動(dòng)。閱讀蛋白主要包括YT521-B同源性(YTH)域家族成員、YTHDF1～3和YTHDC1～3，它們均可以選擇性嵌入共有序列m6A核苷酸的保守m6A結(jié)合域，這有助于募集參與控制mRNA的各種效應(yīng)因子。YTHDC1通過(guò)與pre-mRNA結(jié)合并影響剪接位點(diǎn)的選擇而有助于選擇性剪接[7]。YTHDC2對(duì)不同mRNA翻譯和穩(wěn)定性存在著不同影響，穩(wěn)定生殖細(xì)胞減數(shù)分裂特異的轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)加速有絲分裂的mRNA靶標(biāo)的降解[8]。研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2減少了多種m6A轉(zhuǎn)錄本的半衰期，而YTHDF3與YTHDF1可以協(xié)同加速甲基化RNA的翻譯過(guò)程，也可以與YTHDF2相互作用促進(jìn)mRNA的降解[9]。異質(zhì)核糖核蛋白(heteroribonucleoprotein，HNRNP)家族的某些成員也可作為閱讀蛋白，如HNRNPA2B1為特定的m6A結(jié)合蛋白，通過(guò)與m6A甲基化的轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合來(lái)對(duì)主要的miRNA加工和成熟進(jìn)行促進(jìn)。HNRNPC和HNRNPG可調(diào)節(jié)mRNA的豐度和剪接。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP，包括IGF2BP1/2/3)可以識(shí)別m6A修飾，它以m6A依賴性方式增加靶mRNA的穩(wěn)定性并促進(jìn)其儲(chǔ)存，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄水平和癌癥的發(fā)生發(fā)展，與YTHDF2的作用剛好相反[10]。

2 m6A修飾與泌尿系統(tǒng)腫瘤關(guān)系

m6A修飾不會(huì)改變堿基編碼，但它通過(guò)閱讀蛋白與下游RNA的相互作用，在多水平上影響基因表達(dá)，參與了人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，尤其在癌癥中，扮演著十分重要的角色。研究表明，m6A修飾在多種癌癥中水平失調(diào)，影響腫瘤干細(xì)胞自我更新與分化等過(guò)程，不僅調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，也會(huì)引起其復(fù)發(fā)以及耐藥[11]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GM)中，ADAM19上m6A甲基化修飾降低會(huì)增強(qiáng)癌基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)和自我更新，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]；而同在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中m6A修飾的增強(qiáng)卻可以促進(jìn)成熟mRNA的降解，進(jìn)而加速腫瘤的發(fā)生；在乳腺癌(breast cancer)中，m6A甲基化上調(diào)也會(huì)加速腫瘤的發(fā)生[10]。由此可見(jiàn)，m6A修飾酶表達(dá)水平能改變腫瘤相關(guān)基因mRNA的甲基化水平，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游致癌基因或抑癌基因表達(dá)的調(diào)控，甚至在同一種腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，m6A修飾的表達(dá)能發(fā)揮相反的作用。

2.1 m6A修飾與腎癌

在泌尿系腫瘤中，腎癌是較為常見(jiàn)的一類，其中臨床最常見(jiàn)的類型是腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，由于其早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者均在病情晚期被發(fā)現(xiàn)，預(yù)后多不良，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)很高，病死率較高。

RCC細(xì)胞系總m6A修飾水平和正常腎小管上皮細(xì)胞系相比差異有顯著性，通過(guò)分析19個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)聯(lián)確認(rèn)了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的主要作用[13]。WTAP與METTL3和METTL14的表達(dá)水平相關(guān)，它們共同影響m6A修飾水平。WTAP是唯一與其他5種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶存在已知交互關(guān)系的轉(zhuǎn)移酶，WTAP在ccRCC中顯著上調(diào)，它的高表達(dá)也與ccRCC患者總生存期(overall survival,OS)相關(guān)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，腎癌中METTL3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均較低。低表達(dá)的METTL3通過(guò)以下3種途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展：①敲低METTL3可以通過(guò)調(diào)節(jié)p-PI3k，p-Akt，p-mTOR通路增加p-PI3k，p-Akt，p-mTOR和p-p70的表達(dá)，并減少p-4EBP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；②下調(diào)的METTL3通過(guò)反向調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑中波形蛋白，β-catenin和N-cadherin以及同向調(diào)節(jié)E-cadherin，對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程起到積極促進(jìn)作用；③METTL3的下調(diào)還可以顯著增加G1期的細(xì)胞周期停滯，降低抑癌基因P21的表達(dá)。

此外，ALKBH5高表達(dá)與腫瘤體積、TNM分期以及預(yù)后不良程度呈正相關(guān)[15]。ALKBH5的穩(wěn)定表達(dá)在體外促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，其主要機(jī)制為ALKBH5通過(guò)m6A依賴方式調(diào)節(jié)AURKB mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而影響潛在靶標(biāo)AURKB的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控。敲低的ALKBH5導(dǎo)致RCC細(xì)胞中AURKB mRNA的3′-UTR m6A水平顯著增加。Zheng等[13]發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中m6A結(jié)合蛋白IGF2BP1、IGF2BP2、IGFBP3、HNRNPA2B1表達(dá)上調(diào)。

2.2 m6A修飾與前列腺癌

男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤是前列腺癌(prostate cancer，PC)。近年來(lái)PC的治療發(fā)展迅速，在內(nèi)分泌去勢(shì)治療、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療以及生物分子靶向治療等方面均有所突破，但這些治療只能短期延緩疾病進(jìn)程，無(wú)法做到根治。

Cai等[16]通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和Western印跡分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3在前列腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)。METTL3通過(guò)m6A修飾的方式調(diào)節(jié)GLI、PAPR cleavage、Caspase 3/7、BclG2和Bcl-xL(抗凋亡)蛋白的活性以及SHH(Sonic Hedgehog)信號(hào)通路下游基因mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而改變PC細(xì)胞的增殖、存活、集落形成和遷移能力。YTHDF3基因水平缺失，F(xiàn)TO和ALKBH5擴(kuò)增是前列腺癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。在Ji等[17]收集的病例中發(fā)現(xiàn)約70.2% m6A甲基化調(diào)節(jié)基因的基因拷貝數(shù)變異事件(copy number variations，CNV)是DNA拷貝數(shù)丟失，在所有m6A甲基化調(diào)節(jié)劑CNV中，ZC3H13拷貝數(shù)丟失百分比最高(46.1%)，其次是FTO和YTHDC2。在所有的m6A調(diào)控基因中，YTHDF3、IGF2BP3和HNRNPA2B1拷貝數(shù)增加最常見(jiàn)。通過(guò)研究CNV基因水平的改變和m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的突變與前列腺癌臨床特征之間的關(guān)系，可以明確m6A調(diào)節(jié)劑改變的頻率與較高的TNM分期和生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，PSA和基于METTL14和YTHDF2計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與PC的OS顯著相關(guān)，高危評(píng)分患者發(fā)生PC的HR高于PSA值高的患者，提示METTL14和YTHDF2可以作為PC有效生存預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，具有作為治療靶點(diǎn)的潛力。

2.3 m6A修飾與膀胱癌

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是最常見(jiàn)的泌尿道惡性腫瘤，在男性發(fā)病率中排第4位，死亡率第8位，初診時(shí)70%以上患者可確診為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non muscular invasive bladder cancer，NMIBC)[19]。主要治療方法包括膀胱內(nèi)灌注化療、免疫治療以及對(duì)患者肉眼可見(jiàn)的腫瘤組織進(jìn)行切除的聯(lián)合應(yīng)用，經(jīng)尿道膀胱腫瘤激光整塊切除術(shù)和電動(dòng)力藥等[19]。

METTL3在體內(nèi)或體外的下調(diào)均可以抑制膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)，由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和識(shí)別蛋白YTHDF2組成的m6A調(diào)控軸與膀胱癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。METTL3/YTHDF2 m6A軸可以通過(guò)降解腫瘤抑制因子SETD7和KLF4的mRNA，促進(jìn)BCa的進(jìn)程。因此，METTL3/YTHDF2軸可能是治療BCa的潛在靶標(biāo)。METTL14在膀胱癌和膀胱腫瘤起始細(xì)胞(TICs)中也存在低表達(dá)。Gu等[21]發(fā)現(xiàn)，Notch1是METTL14 m6A修飾的功能靶基因，METTL14的敲除大大增加了Notch1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膀胱TICs的增殖、自我更新、轉(zhuǎn)移和腫瘤起始能力。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)METTL14/m6A/ Notch1途徑對(duì)膀胱癌進(jìn)行干預(yù)及治療。

Jin等[22]發(fā)現(xiàn)，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5通過(guò)調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中ITGA6的表達(dá)來(lái)改變細(xì)胞黏附功能。在大多數(shù)膀胱癌樣本中，ITGA6和METTL3表達(dá)中等或較高，而ALKBH5表達(dá)較低。在人組織微陣列中ITGA6的上調(diào)與人BCa組織中METTL3的表達(dá)增加和ALKBH5表達(dá)降低相關(guān)，且ITGA6高表達(dá)的患者存活率較低，膀胱癌患者腫瘤樣品ITGA6表達(dá)水平與組織學(xué)等級(jí)和分期呈正相關(guān)。因此，m6A修飾的ITGA6可確定為治療BCa的潛在治療靶標(biāo)。

2.4 m6A修飾與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)是15～44歲男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前臨床中TGCT的治療主要依賴于主動(dòng)監(jiān)測(cè)，輔助單劑量卡鉑化療、順鉑化療、放療和腹膜后淋巴結(jié)清掃術(shù)。早期TGCT經(jīng)治療后長(zhǎng)期存活率接近100%[23]，因此，找到早期診斷TGCT的靶標(biāo)對(duì)患者的治療和預(yù)后有著極大的意義。Nettersheim等[24]發(fā)現(xiàn)，在GCT組織和細(xì)胞系中，成纖維細(xì)胞和不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞的RNA中可檢測(cè)到與METTL3、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC相關(guān)的m6A甲基化修飾，且分化后的GCT細(xì)胞的RNA中m6A修飾水平增加，提示m6A修飾與GTCs的進(jìn)展有密切關(guān)聯(lián)。Lobo等[25]發(fā)現(xiàn)，在TGCT的不同類型精原細(xì)胞瘤(Seminomas，SEs)和非精原細(xì)胞瘤(Non-Seminomatous tumors，NSTs)中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶VIRMA和m6A閱讀蛋白YTHDF3 mRNA的表達(dá)水平有所不同。

順鉑是包括SEs在內(nèi)多種腫瘤中使用最廣泛的化療藥物之一。順鉑在抗腫瘤治療中起著雙重作用，在治療的同時(shí)常伴有毒性和耐藥性。Wei等[26]發(fā)現(xiàn)，METTL3高表達(dá)可以在耐順鉑精原細(xì)胞TCam-2中提高TFAP2C mRNA的m6A修飾水平，增強(qiáng)了TFAP2C mRNA的穩(wěn)定性，TFAP2C的高表達(dá)與某些類型腫瘤的不良存活率相關(guān)。同時(shí)，IGF2BP1作為m6A甲基識(shí)別蛋白，也可以增強(qiáng)TFAP2C mRNA的m6A甲基化，而TFAP2C通過(guò)激活DNA修復(fù)基因WEE1和BRCA1，增加了該環(huán)境下TCam-2-CDDP細(xì)胞的活力，影響著細(xì)胞對(duì)CDDP治療壓力的反應(yīng)。

3 總結(jié)與展望

m6a甲基化修飾通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和閱讀蛋白在腎癌、前列腺癌、膀胱癌和睪丸癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤中起到了抑制癌基因表達(dá)或促進(jìn)癌基因表達(dá)的作用，這是因?yàn)閙6A修飾在RNA上有多個(gè)靶點(diǎn)，而各個(gè)靶點(diǎn)下游相關(guān)RNA和蛋白的表達(dá)機(jī)制及相互作用不盡相同。目前，以m6A甲基化為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療仍局限在某些信號(hào)傳導(dǎo)通路或者說(shuō)是某些基因上，且仍未應(yīng)用于臨床，主要原因在于對(duì)各條信號(hào)通路本身以及與其他通路上基因的相互作用并不清晰。

綜上所述，伴隨m6A修飾功能研究的逐步擴(kuò)展和深入，m6A調(diào)控相關(guān)蛋白靶向藥物的研發(fā)也逐漸增多，RNA甲基化修飾研究在泌尿系統(tǒng)腫瘤早期診斷、精準(zhǔn)治療、預(yù)后預(yù)測(cè)、預(yù)防復(fù)發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用前景。