江 嵐， 鄧 強(qiáng)， 龍鼎新

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市421001; 2.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市421001)

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要依賴于Ca2+和磷脂激活，Ca2+作為第二信使廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，Ca2+信號(hào)的釋放會(huì)引起細(xì)胞死亡機(jī)制觸發(fā)，下游表型體現(xiàn)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)增殖分化、胞內(nèi)分子分泌、自噬和凋亡等各種細(xì)胞生理過(guò)程[1]，通過(guò)磷酸化來(lái)介導(dǎo)其他蛋白的功能[2]。已知PKC共有10個(gè)亞型，其可分為3組：常規(guī)PKC(cPKC)包括α、βI、βII和γ亞型；新型PKC(nPKC)包括δ、ε、η和θ亞型；非典型PKC(aPKC)包括ι(也稱為小鼠λ)和ζ亞型[3]。PKCα廣泛存在于哺乳動(dòng)物的肌肉、腦、肺、皮膚、心等組織中[4]。PKCα含有C1和C2結(jié)構(gòu)域，其可以通過(guò)二?；视?DAG)和Ca2+在磷脂酰絲氨酸的存在下被激活，并參與多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期進(jìn)程、腫瘤發(fā)生、遷移和自噬[4]。例如PKCα使滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(Trop-2)磷酸化，增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力[5]；敲低PKCα可以降低LC3-II和自噬通量的水平[6]。PKCα還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如PKCα在糖尿病妊娠中通過(guò)miR-129-2抑制自噬并誘導(dǎo)神經(jīng)管缺陷[7]；在炎性關(guān)節(jié)炎疼痛模型中，PKCα上調(diào)傷害性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的鈉通道Nav1.9[8]；蘋果樹酚類提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)PKCα信號(hào)通路并減輕鉛(II)暴露小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)維持肝腎功能[9]；PKCα通過(guò)刺激自噬通量調(diào)節(jié)腎纖維化和成纖維細(xì)胞活化[10]。

細(xì)胞內(nèi)含有非常多樣的與PKCα直接相互作用的蛋白分子，可以很好地調(diào)節(jié)其活性，在很多信號(hào)通路中，PKCα都發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于中樞地位，是多種信號(hào)途徑的整合者。本文基于生物信息學(xué)方法，對(duì)人PKCα蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，為PKCα的機(jī)制研究等提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 人PKCα蛋白序列的獲得

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/檢索人PKCα序列，下載人PKCα蛋白的氨基酸序列。

1.2 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

采用CBS中的TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，通過(guò)在線的方式針對(duì)人PKCα蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 亞細(xì)胞定位分析

對(duì)人PKCα蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，使用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcompan)分析，以獲得蛋白定位結(jié)果。

1.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對(duì)人PKCα蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，主要通過(guò)ProtParam[10]程序來(lái)實(shí)現(xiàn)，囊括了氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)以及總平均親水性；利用Protscale[11]程序(http://web.expasy.org/protscale)對(duì)人PKCα蛋白進(jìn)行親疏水性測(cè)定；主要采用SignalP-4.0[12]測(cè)定人PKCα蛋白有無(wú)信號(hào)肽及切割位點(diǎn)。

1.5 磷酸化位點(diǎn)分析

使用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetP hos/)針對(duì)人PKCα蛋白磷酸化位點(diǎn)通過(guò)在線的方式來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用PHD(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)在線預(yù)測(cè)人IP3R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用SWISS-MODL對(duì)PKCα三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 蛋白信息和相互作用蛋白預(yù)測(cè)

利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)分析跨膜螺旋區(qū)域、二硫橋以及結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)在線預(yù)測(cè)人PKCα蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 人PKCα蛋白序列的查找

登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)，下載獲得人PKCα蛋白氨基酸序列，其NCBI序列號(hào)為BAU98542.1。

2.2 人PKCα蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域作為跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，其主要存在于蛋白質(zhì)序列中，通常情況下采用TMHMM在線軟件來(lái)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的分析，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示，人PKCα蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 人PKCα蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.3 人PKCα蛋白亞細(xì)胞定位

運(yùn)用ProtComp 9.0對(duì)人PKCα蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。PKCα蛋白定位在質(zhì)膜上的可能性為71.4%，而定位于其他細(xì)胞器或胞外的概率并不大。

2.4 人PKCα蛋白理化性質(zhì)分析

選擇采用ProtParam在線分析顯示人PKCα蛋白為親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)38.12%，表明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。針對(duì)人PKCα蛋白，依托于Protscale來(lái)分析其疏水性和親水性，其中親水性最強(qiáng)的是326位的谷氨酰胺(Q)，而位于451位的亮氨酸(L)親水性最弱(圖2)。對(duì)上述PKCα的疏水性和親水性值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，PKCα的親水性氨基酸殘基總和為-456.897，而疏水性氨基酸殘基總和為116.053。PKCα經(jīng)過(guò)上述分析后確定為親水性蛋白。

圖2 人PKCα蛋白疏水性和親水性預(yù)測(cè)

2.5 人PKCα蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

對(duì)人PKCα蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，粉色線條以上表示閾值超過(guò)0.5，不同顏色柱狀表示不同氨基酸Ser、Thr、Tyr。結(jié)果顯示，人PKCα蛋白含23個(gè)Ser，19個(gè)Thr，9個(gè)Tyr，可能作為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)存在(圖3)。

圖3 人PKCα蛋白的磷酸化位點(diǎn)

2.6 人PKCα蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)結(jié)果

對(duì)人PKCα蛋白信號(hào)肽及切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示并不存在信號(hào)肽位點(diǎn)，因此可以將其判定為非分泌性蛋白(圖4)。

圖4 人PKCα蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.7 人PKCα蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

PKCα蛋白質(zhì)含有大量無(wú)規(guī)則卷曲，約占52.68%，推測(cè)無(wú)規(guī)則卷曲為PKCα最大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件，余下依次為α-螺旋約占23.36%和延伸鏈約占23.96%(圖5)。

圖5 人PKCα蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.8 人PKCα蛋白信息預(yù)測(cè)

以PredictProtein對(duì)人PKCα蛋白的蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，獲得跨膜螺旋等信息。PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果為PKCα有15個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，無(wú)跨膜螺旋區(qū)域在預(yù)測(cè)結(jié)果方面等同于TMHMM，并不存在任何的二硫鍵(圖6)。

圖6 PKCα結(jié)合位點(diǎn)、跨膜螺旋區(qū)域、二硫鍵預(yù)測(cè)

2.9 人PKCα蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能預(yù)測(cè)

人PKCα蛋白主要與PICK1、SDC4、BRAF、AKAP150和PLD1等蛋白質(zhì)相互作用。對(duì)人PKCα蛋白互作蛋白進(jìn)行GO分析，PKCα分子功能本體論結(jié)果表明：該蛋白具有蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、雜環(huán)化合物的結(jié)合、核苷磷酸結(jié)合和小分子結(jié)合等的可靠性較高(表1)；PKCα生化過(guò)程本體論結(jié)果表明：該蛋白參與細(xì)胞代謝過(guò)程、高分子改性、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞蛋白修飾過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、初級(jí)代謝過(guò)程等的可靠性較高(表2)；PKCα細(xì)胞成分本體論結(jié)果表明：該蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的部分、細(xì)胞質(zhì)、胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、膜結(jié)合細(xì)胞器、核等的可靠性較高(表3)。

表1 PKCα分子功能本體論

表2 PKCα生化過(guò)程本體論

表3 PKCα細(xì)胞成分本體論

2.10 人PKCα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用SWISS-MODL對(duì)人PKCα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，GMQE在此處具體為0.73，QMEAN在此處具體為-2.64，序列與3pfq.1.A模板序列具有非常高的相似度，達(dá)到了79.85%，這意味著該模型具有相對(duì)合理的結(jié)構(gòu)。該蛋白質(zhì)扭曲非常多，擁有著豐富的結(jié)構(gòu)，此類結(jié)構(gòu)對(duì)生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用(圖7)。

圖7 人PKCα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討 論

生物信息學(xué)是一門以計(jì)算機(jī)為手段，綜合運(yùn)用生物學(xué)、信息科學(xué)、數(shù)學(xué)等多學(xué)科方法的交叉學(xué)科。其主要是對(duì)大量的生物信息進(jìn)行獲取、處理、儲(chǔ)存、分析和解釋，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的信息和規(guī)律[13]。

PKCα在機(jī)體中扮演著極其重要的角色，PKCα研究快速推進(jìn)，本課題第一次對(duì)PKCα蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示PKCα蛋白定位于胞膜和無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。有研究報(bào)導(dǎo)，PKCα能被第二信使Ca2+和二?；视?DAG)激活，從無(wú)活性的胞質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘哪は嚓P(guān)狀態(tài)，這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變用以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，如基因表達(dá)[14]、遷移[15]、增殖[16]和細(xì)胞凋亡[17]。而PKCα蛋白C末端區(qū)域的保守基序的疏水性區(qū)域在調(diào)節(jié)其活性中起著雙重作用：通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的敏化而激活，通過(guò)與C2結(jié)構(gòu)域的保守帶正電區(qū)域相互作用而自動(dòng)抑制[18]。后續(xù)蛋白信息預(yù)測(cè)PKCα蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶活性等，與前人結(jié)果一致。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示無(wú)規(guī)則卷曲以及α-螺旋作為PKCα核心二級(jí)結(jié)構(gòu)原件。在細(xì)胞內(nèi)，磷酸化以及去磷酸化作為重要傳導(dǎo)途徑，因此必須要分析磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，PKCα蛋白所擁有的磷酸化位點(diǎn)主要包括了Ser、Thr和Tyr，其中最多的就是Ser位點(diǎn)，判斷Ser蛋白激酶在蛋白磷酸化中可能扮演著極其重要的角色。最近幾年，研究結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致，滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(Trop-2)在Ser-322處被PKCα磷酸化，并且這種磷酸化增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并降低了claudin-7定位于細(xì)胞邊界[5]。其無(wú)二硫鍵，其表現(xiàn)出鈣釋放通道活性等。研究表明鈣通過(guò)與鈣傳感器PKCα和鈣調(diào)蛋白結(jié)合而刺激內(nèi)吞作用，這對(duì)于維持突觸傳遞和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)至關(guān)重要[19]。蛋白質(zhì)間相互作用也很關(guān)鍵，深入分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)這種相互作用系統(tǒng)了解，最終發(fā)現(xiàn)人PKCα蛋白主要與PICK1、SDC4、BRAF、AKAP150和PLD1等蛋白質(zhì)相互作用。最新研究結(jié)果顯示：PICK1是一種支架蛋白，可通過(guò)蛋白激酶PKCα(PRKCA)促進(jìn)其蛋白伴侶的磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性[20]；在攜帶BRAF突變的黑色素瘤患者中，PKCα過(guò)表達(dá)使患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加11倍[21]；SDC4可以直接與絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)中活化的PKCα結(jié)合，而抑制PKCα可以降低EVT的入侵和遷移[22]；L型Ca2+通道功能的局部控制受AKAP150靶向的PKCα信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)，該信號(hào)傳導(dǎo)在生理?xiàng)l件下控制持續(xù)的Ca2+內(nèi)流、血管緊張度和血壓，并且是血管緊張素II依賴性高血壓的基礎(chǔ)[23]；弓形蟲靶向GRA7的ASC和PLD1通過(guò)PKCα促進(jìn)抗菌宿主防御[24]。

本文針對(duì)人PKCα蛋白序列展開了生物信息學(xué)分。此階段必然需要用到生物學(xué)軟件和平臺(tái)固定模式，軟件參數(shù)設(shè)置存在著差異，導(dǎo)致有不同的結(jié)果，因此這一分析方法具有局限性。可以嘗試采用多軟件多平臺(tái)綜合分析，保證更為精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)。進(jìn)而研究蛋白重要功能區(qū)域，此后通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。