劉丹陽，徐遵濤,2，丁 勇*

(1 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230027;2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，合肥 230031)

開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，適當(dāng)?shù)拈_花時間是高等植物有性繁殖成功的基礎(chǔ)[1-2]。植物的開花時間受到內(nèi)部環(huán)境和外界環(huán)境共同調(diào)控，主要的調(diào)控途徑可分為光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑和溫度途徑，這些途徑協(xié)同作用，精確調(diào)控擬南芥的成花轉(zhuǎn)變過程[3-5]。

作為開花通路中關(guān)鍵的開花抑制基因，F(xiàn)LOWERINGLOCUSC(FLC) 編碼一類MADS box轉(zhuǎn)錄因子，通過直接抑制2個開花通路整合因子FLOWERINGLOCUST(FT) 和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1) 的轉(zhuǎn)錄來抑制開花[6-8]。FLC受到春化途徑和自主途徑的調(diào)控。在春化過程中，VERNALIZATION 5 (VRN5)、VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3) 和VERNALIZATION 2 (VRN2) 等形成的PHD-PRC2復(fù)合體，對FLC位點表觀沉默，抑制FLC表達(dá)從而促進(jìn)開花[8]。而在自主途徑中，F(xiàn)CA、FY、FPA、Flowering locus VE (FVE)、FLOWERING LOCUS K (FLK) 和FLOWERING LOCUS D (FLD) 通過RNA的代謝和染色質(zhì)狀態(tài)的調(diào)控，抑制FLC轉(zhuǎn)錄[9]。

N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine, m6A) 就是腺苷酸第6位氮原子上的氫原子被甲基所替換，這一修飾在RNA修飾中的比例高至80%，在mRNA中的比例達(dá)到50%[10]。m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和m6A“閱讀器”共同參與。m6A“閱讀器”識別并結(jié)合m6A修飾的RNA，影響其行使生物學(xué)功能。

哺乳動物中YTHDF (YTH domain family) 家族蛋白是一類YTH (YT521-B homology) 結(jié)構(gòu)域蛋白，包括YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，它們能夠識別并結(jié)合m6A修飾的RNA，具有不同的生物學(xué)功能。相關(guān)研究表明，YTHDF1促進(jìn)mRNA的翻譯，YTHDF2促進(jìn)mRNA的降解，而YTHDF3同時促進(jìn)翻譯和降解[11-14]。擬南芥中的ECT蛋白家族是YTHDF家族的同源蛋白?，F(xiàn)有研究表明，ECT可參與擬南芥生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)的調(diào)控。ECT2可調(diào)控擬南芥的毛狀體分枝數(shù)量，這一調(diào)控作用依賴于其m6A結(jié)合能力[15-16]。此外，ECT2、ECT3和ECT4共同作用，控制葉片形成時間和葉片形態(tài)發(fā)育[17]。熱處理后ECT2進(jìn)入應(yīng)激顆粒中，這表明ECT可能參與脅迫響應(yīng)[15]。然而，擬南芥ECT家族基因能否參與調(diào)控開花時間，尚未見報道。

本研究通過qRT-PCR的方法，對開花相關(guān)基因ECT6和ECT7參與擬南芥開花時間的調(diào)控進(jìn)行分析，初步探討了ECT6和ECT7調(diào)控開花時間的分子機(jī)理，為研究ECT家族和m6A在開花調(diào)控中的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本研究材料為野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型 (Col-0)，T-DNA插入突變體ect6-1 (SAIL_76_D06)、ect6-2 (SALK_083381)、ect7-1 (SALK_203118)和ect7-2 (SALK_105881) 購自美國ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) 種子庫。研究中用到的雙突變體材料ect6-1ect7-1和ect6-2ect7-2通過突變體雜交獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取與基因型鑒定(1)基因組提?。喝∩L20 d左右的野生型和突變體幼苗，利用CTAB法提取其基因組。加入CTAB溶液并高速破碎，通過氯仿萃取、異丙醇沉淀、75%乙醇沉淀以提取得到擬南芥基因組。

(2)基因型鑒定：分別在目的基因的基因組上T-DNA插入位點兩側(cè)(LP和RP)和T-DNA插入?yún)^(qū)段上 (BP) 設(shè)計引物，通過三引物法進(jìn)行PCR鑒定(表1)。T-DNA的長度較長，大于10 kb，PCR無法跨T-DNA擴(kuò)增出條帶。因此，野生型的兩條染色體上均沒有T-DNA插入，可擴(kuò)增出以LP+RP為引物的條帶(一條帶，約900 bp)；純合突變體的兩條染色體上均有T-DNA插入，可擴(kuò)增出以BP+RP為引物的條帶(一條帶，約400～700 bp)；雜合子：等位基因的一條染色體上有T-DNA插入，而另一條染色體上無T-DNA插入，不僅能擴(kuò)增出以LP+RP為引物的條帶，還能擴(kuò)增出以BP+RP為引物的條帶(兩條帶)。PCR反應(yīng)體系 (20 μL)：0.2 μL EasyTaq，2.0 μL 10×EasyTaq Buffer，0.4 μL LP，0.4 μL RP，0.4 μL BP，0.4 μL dNTP，2 μL模板和14.2 μL ddH2O；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，其中變性、退火、延伸步驟循環(huán)34次。

1.2.2 RNA提取、半定量及qRT-PCR分析(1)RNA提取：取生長14 d的野生型和ect6ect7雙突變體幼苗，加入液氮研磨至粉末狀，采用Trizol (TransGen Bio-tech) 試劑提取植物葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

(2)半定量檢測：按照PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增內(nèi)參基因Tublin和目的基因(表1)。通過調(diào)整模板cDNA的加入比例，以使野生型和突變體中內(nèi)參基因Tublin的表達(dá)量一致，比較野生型和突變體中目的基因的表達(dá)量。

(3)qRT-PCR分析：在qPrimerDB網(wǎng)站上進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(表1)，采用SYBR superMIX試劑盒 (TransGen Bio-tech)，利用定量PCR儀器 (Bio-Rad) 擴(kuò)增，以UBQ為內(nèi)參，并通過2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。其中，qRT-PCR反應(yīng)體系 (20 μL)：10 μL 2×Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，3.0 μL模板cDNA和6.6 μL ddH2O；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，運行40個循環(huán)，融解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

表1 PCR和qRT-PCR的引物序列

1.2.3 載體構(gòu)建對pCAMBIA2300-35S∷eGFP載體進(jìn)行雙酶切(酶切位點為SalⅠ和XbaⅠ)并膠回收酶切后的載體。利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計，上游引物為載體上的序列 (15 bp) +SalⅠ 酶切位點 (6 bp) +目的片段上的上游引物 (24 bp)，下游引物為載體上的序列 (15 bp) +XbaⅠ 酶切位點 (6 bp) +目的片段上的下游引物 (24 bp)，PCR擴(kuò)增目的片段。將酶切后的載體與目的片段同源重組，以獲得融合GFP標(biāo)簽的過表達(dá)載體。

1.2.4 煙草注射與亞細(xì)胞定位觀察將融合GFP標(biāo)簽的過表達(dá)載體電轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中，28 ℃培養(yǎng)3 d，活化后3 300 r/min離心棄上清。用煙草轉(zhuǎn)化液重懸菌體，調(diào)OD值至0.7。含過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌與含P19的農(nóng)桿菌(促進(jìn)異源蛋白表達(dá))等體積混合，室溫避光放置2 h，注射煙草葉片。弱光培養(yǎng)48～72 h，撕取葉片下表皮細(xì)胞置于載玻片上，加入細(xì)胞核染色液DAPI，于共聚焦顯微鏡 (ZEISS Xradia 880) 下觀察熒光信號并捕捉熒光圖像。

1.2.5 開花表型觀察與分析將野生型和突變體擬南芥種植在22 ℃ 長日照(16 h光照/8 h黑暗)或短日照(16 h黑暗/8 h光照)溫室，觀察抽薹時間，統(tǒng)計25株以上蓮座葉和莖生葉數(shù)量，以總?cè)~片數(shù)的平均值作為開花時間的統(tǒng)計值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ect6與ect7突變體獲得與表型觀察

為了研究ECT6與ECT7的生物學(xué)功能，首先從擬南芥ABRC種子庫訂購了T-DNA插入突變體ect6-1 (SAIL_76_D06)、ect6-2 (SALK_083381)、ect7-1 (SALK_203118) 和ect7-2 (SALK_105881)。ect6突變體的2個株系ect6-1和ect6-2分別插入在ECT6基因的第3和第5外顯子(圖1，A)。為了確認(rèn)這兩種突變體是ECT6功能缺失突變體，首先在基因組水平上進(jìn)行基因型鑒定。分別在ECT6基因的基因組上T-DNA插入位點兩側(cè)(LP和RP)和T-DNA插入?yún)^(qū)段上 (BP) 設(shè)計引物，通過三引物法進(jìn)行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)：Col-0可以擴(kuò)增出LP+RP的條帶，而ect6突變體只能擴(kuò)增出BP+RP的條帶，表明ect6突變體是純合突變體(圖1，B)。ect7突變體的2個株系ect7-1和ect7-2。分別插入在ECT7基因的第6和第4外顯子(圖1，A)。同樣對ect7突變體進(jìn)行三引物法鑒定，發(fā)現(xiàn)ect7突變體也是純合突變體(圖1，B)。半定量PCR結(jié)果顯示，能從Col-0植株中擴(kuò)增出ECT6和ECT7的全長轉(zhuǎn)錄本，而突變體ect6和ect7分別無法擴(kuò)增出ECT6、ECT7的全長轉(zhuǎn)錄本，表明突變體ect6和ect7是完全敲除突變體(圖1，C)隨后將ect6和ect7突變體分別種植在長日照條件下觀察表型并統(tǒng)計葉片數(shù)。發(fā)現(xiàn)與Col-0相比，ect6和ect7突變體均表現(xiàn)出葉片數(shù)減少和開花時間提前(圖1，D、E)。結(jié)果表明：ECT6和ECT7基因的功能缺失會促進(jìn)擬南芥的成花轉(zhuǎn)變，使擬南芥植株提前開花。

A.ECT6和ECT7的基因結(jié)構(gòu)及突變體插入位點示意圖：空心方框表示UTR，實心方框表示外顯子，黑色直線表示內(nèi)含子，倒三角表示T-DNA插入位點；B. 突變體的基因型鑒定；C. 突變體的半定量鑒定；D. 長日照下ect6突變體表型和葉片數(shù)；E. 長日照下ect7突變體表型和葉片數(shù)；采用Student’s t test進(jìn)行顯著性檢驗 (* P < 0.05)

2.2 ect6 ect7雙突變體的表型觀察

ECT6與ECT7基因在功能上可能存在冗余，因此，將突變體ect6與ect7進(jìn)行雜交，得到ect6ect7雙突變體。接下來將Col-0、ect6-2、ect7-2和ect6-2ect7-2突變體種植在長日照條件下觀察表型。發(fā)現(xiàn)與Col-0相比，ect6-2、ect7-2和ect6-2ect7-2雙突變體均表現(xiàn)出早花表型，并且ect6ect7雙突變體的早花表型比ect6-2和ect7-2突變體更加顯著，葉片數(shù)也更少(圖2，A)。這一結(jié)果表明ECT6與ECT7基因功能冗余，共同調(diào)控開花。在短日照條件下，ect6ect7雙突變體也具有早花的表型(圖2，B)。這些結(jié)果表明：ECT6與ECT7并非通過光周期途徑來調(diào)控開花。

A.長日照下ect6 ect7雙突變體表型和葉片數(shù)；B. 短日照下ect6 ect7雙突變體表型和葉片數(shù)；采用Student’s t test進(jìn)行顯著性檢驗 (* P < 0.05)

2.3 ECT6和ECT7亞細(xì)胞定位

將ECT6和ECT7分別與GFP標(biāo)簽融合，利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對ECT6和ECT7蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位的觀察。發(fā)現(xiàn)ECT6和ECT7的GFP熒光信號與細(xì)胞核染料DAPI的熒光信號存在重疊，此外，部分GFP熒光信號分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖3，A、B)。結(jié)果表明：ECT6和ECT7均分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 ECT6 (A) 和ECT7 (B) 的亞細(xì)胞定位

2.4 關(guān)鍵開花相關(guān)基因檢測

為了解析ect6ect7雙突植株呈現(xiàn)早花表型的分子機(jī)制，檢測14 d齡幼苗中成花素基因FT的表達(dá)水平，結(jié)果表明，ect6ect7雙突變體中FT的表達(dá)水平顯著高于野生型(圖4，A)，這與在突變體中觀察到的早花表型一致(圖2，A)。考慮到長、短日照條件下表型的一致性，推測突變體中FT的升高可能是通過FLC調(diào)控的，因此檢測了FLC的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)雙突變體中FLC的表達(dá)水平顯著低于野生型(圖4，A)。FLC可同時受到春化途徑和自主途徑的調(diào)控，進(jìn)一步檢測春化途徑和自主途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)春化通路基因VIN3、VRN2和VRN5在ect6ect7雙突變體中的表達(dá)水平均顯著高于野生型(圖4，B)。自主途徑關(guān)鍵基因FPA、FLK、FLD、FCA和FY的表達(dá)水平在野生型和突變體之間無顯著差異，而ect6ect7雙突變體中FVE基因的表達(dá)水平顯著高于野生型(圖4，B)。

A.FT和FLC的表達(dá)；B.春化途徑和自主途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)；采用Student’s t test進(jìn)行顯著性檢驗 (* P < 0.05, ** P < 0.01)

這些結(jié)果表明：ECT6和ECT7可通過FLC來調(diào)控成花素基因FT的表達(dá)水平，從而調(diào)控成花轉(zhuǎn)變，并且ECT6和ECT7對FLC的調(diào)控依賴于春化途徑和自主途徑。

3 討 論

m6A是高等真核生物mRNA上含量最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾[10]。m6A的生物學(xué)功能往往依賴于m6A結(jié)合蛋白。在哺乳動物中，YTHDF家族是m6A的結(jié)合蛋白，分別為YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。它們通過識別并結(jié)合mRNA上的m6A修飾，調(diào)控mRNA的翻譯和降解來發(fā)揮功能[11-14]。而模式植物擬南芥中的ECT家族同樣包含YTH結(jié)構(gòu)域，被預(yù)測為m6A的“閱讀器”。擬南芥中的ECT家族共包含11個成員[15]，數(shù)量遠(yuǎn)大于哺乳動物，這表明擬南芥中的ECT家族基因很可能存在一定的功能冗余和功能分化。

之前的研究表明，擬南芥ECT家族基因參與生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)的調(diào)控。ECT2通過其m6A識別能力來影響毛狀體分枝數(shù)量[15-16]。ECT2、ECT3和ECT4功能冗余，共同調(diào)控葉片形成時間和葉片形態(tài)[17]。ECT2在常溫下定位在細(xì)胞質(zhì)中，熱處理后定位至應(yīng)激顆粒中[15]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ECT1和ECT2可與脅迫響應(yīng)蛋白calcineurin b-like-interacting protein kinase 1 (CIPK1) 特異性相互作用，暗示ECT1和ECT2可能與脅迫響應(yīng)相關(guān)[18]。然而關(guān)于擬南芥ECT家族的其他成員未見報道，并且ECT是否參與開花調(diào)控尚不清楚。我們的研究表明：ECT6和ECT7的功能缺失導(dǎo)致早花表型，表明ECT6和ECT7參與擬南芥開花時間的調(diào)控。

開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的過程，合適的開花時間對于植物成功繁衍后代非常關(guān)鍵。FLC是開花通路中關(guān)鍵的開花抑制因子，通過調(diào)控下游的FT來抑制開花。我們的qRT-PCR結(jié)果顯示，在ect6ect7雙突變體中，F(xiàn)LC的表達(dá)水平與Col-0相比顯著下調(diào)，而FT的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖4，A)，這與我們觀察到的ect6ect7雙突變體的早花表型一致。

上游的春化途徑以及自主途徑共同調(diào)控FLC的表達(dá)。在春化過程中，VRN2被誘導(dǎo)表達(dá)，VRN2、VIN3與VRN5相關(guān)聯(lián)，通過調(diào)控FLC的染色質(zhì)狀態(tài)來抑制FLC的轉(zhuǎn)錄[19-22]。自主途徑中的FVE可通過調(diào)控FLC的乙酰化水平來抑制FLC的表達(dá)[23]。因此，我們也檢測了春化途徑和自主途徑中相關(guān)基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)在ect6ect7雙突變體中，F(xiàn)LC抑制基因VIN3、VRN2、VRN5和FVE的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖4，B)，這很好地解釋了突變體中FLC表達(dá)水平顯著下調(diào)。雖然ECT6和ECT7通過影響這些基因的表達(dá)間接調(diào)控FLC的轉(zhuǎn)錄，但并不能排除ECT6和ECT7作為m6A的“閱讀器”，通過直接結(jié)合m6A修飾的FLCmRNA來調(diào)控FLC轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，實現(xiàn)對FLC和開花時間的調(diào)控。在未來的工作中，我們需要對FLCmRNA是否存在m6A修飾及ECT是否與之結(jié)合進(jìn)行探索。

綜上所述，本研究初步解析了擬南芥ECT6和ECT7在開花時間調(diào)控中的生物學(xué)功能，揭示了擬南芥ECT基因存在功能冗余和分化，為進(jìn)一步研究m6A/ECT在植物生長發(fā)育中的功能提供線索。