杜 萍，吳慶蓮，伊文一，焦體坤，胡夢琪，黃 瑩

(臨沂大學 農(nóng)林科學學院，山東臨沂 276000)

莖用萵苣(LactucasativaL.)是一年生或二年生菊科萵苣屬草本植物，主要以肉質(zhì)嫩莖作為蔬菜食用，其適應(yīng)環(huán)境能力強，可在春秋兩季或越冬栽培，是中國一種重要的經(jīng)濟作物[1]。萵苣肉質(zhì)莖含有豐富的糖類、膳食纖維、鐵、鉀、磷、鈣、鈉、葉酸、維生素等營養(yǎng)成分，是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚氖卟俗魑镏籟2]。目前對于萵苣的研究主要集中在葉用萵苣(生菜)上，對莖用萵苣生長發(fā)育以及響應(yīng)逆境的研究較少，而這些因素會嚴重影響莖用萵苣的生長發(fā)育，進而影響莖用萵苣的產(chǎn)量和品質(zhì)。

植物在整個生命周期中會遇到各種非生物和生物脅迫，這些脅迫可以影響植物的生長發(fā)育甚至改變植物物種的分布[3]。高等植物不能通過移動來逃避各種不利環(huán)境因素，因此為了抵抗逆境脅迫，植物采取了一系列復雜的響應(yīng)機制[4]。許多脅迫相關(guān)基因包括轉(zhuǎn)錄因子可直接保護植物免受脅迫，或通過誘導/抑制下游靶基因進行調(diào)控[5]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中一大類調(diào)控蛋白家族，含有由60個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合各種脅迫相關(guān)基因啟動子區(qū)域的W-box順式元件(TTGACC/T)，從而調(diào)節(jié)這些基因的表達，進而參與植物對各種脅迫的響應(yīng)[6-8]?；赪RKY保守域的數(shù)量和鋅指基序的結(jié)構(gòu)，可將WRKY家族分為3個亞族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中WRKYⅡ亞族可以進一步分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[9-10]。與WRKYⅠ和WRKYⅡ相比，WRKYⅢ亞族含有C2HC鋅指結(jié)構(gòu)(C-X7-C-X23-H-X1-C)，同時在植物進化過程中，WRKYⅢ亞族被認為是3個亞族中適應(yīng)性最強、最先進的亞族[11]。

研究表明，WRKY蛋白在生物脅迫(如害蟲、病原感染)、非生物脅迫(如干旱、鹽、低溫、高溫、活性氧等)、激素和生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11-13]。目前已在多種植物中克隆得到了WRKY轉(zhuǎn)錄因子[14-18]，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、黃瓜(Cucumissativus)[15]、番茄(Solanumlycopersicum)[16]、西瓜(Cucumismelo)[17]、岷江百合(LiliumregaleWilson)[18]等。同樣WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子也在多種植物中得到鑒定[19-21]，如甘蔗(Saccharumofficinarum)[11]、棉花(Gossypiumhirsutum)[19]、蘭花(Cymbidiumgoeringii)[20]、小麥(Triticumaestivum)[21]等，但莖用萵苣中的有關(guān)WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子的報道還很少。

本研究選取莖用萵苣品種‘永安紅’為實驗材料，克隆了2個WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因LsWRKY08和LsWRKY37，對其進行了較為詳盡的生物信息學分析，包括氨基酸理化性質(zhì)、疏水性/親水性、進化樹構(gòu)建、序列比對等，還通過實時定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)對2個基因在莖用萵苣不同組織、不同激素、不同非生物脅迫以及莖不同膨大時期的表達進行了研究，以初步分析WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子在莖用萵苣生長發(fā)育以及逆境脅迫中的作用，為提高莖用萵苣的抗性提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

將莖用萵苣品種‘永安紅’種子種植于穴盤中，種植所用基質(zhì)為泥炭(丹麥品氏托普pindstrup)和蛭石按1∶1(體積比，V/V)混合而成，放于人工氣候室中(22 ℃/18 ℃各12 h)。在長至4片真葉后，分別進行低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)、鹽(0.2 mol/L NaCl)、干旱(20% PEG6000)處理幼苗以模擬不同的非生物脅迫；分別用水楊酸(5 mmol/L SA)、脫落酸(75 μmol/L ABA)和赤霉素(50 μmol/L GA)進行噴施，對照組噴施蒸餾水；在處理0、12、24、48 h后，分別取以上處理的葉片樣品凍于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)RNA的提取。取不同膨大時期(肉質(zhì)莖直徑長1、2、3和4 cm)的萵苣莖組織凍于-80 ℃冰箱，以分析LsWRKY08和LsWRKY37在莖不同膨大時期的表達模式。將以上不同處理的樣品根據(jù)RNA simple Total RNA Kit試劑盒(北京天根公司)說明書分別提取總RNA，并用PrimeScript RT readent Kit(大連TaKaRa公司)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于熒光定量PCR。

1.2 方 法

1.2.1 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析根據(jù)萵苣的基因組數(shù)據(jù)庫和本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到2個莖用萵苣WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因LsWRKY08和LsWRKY37序列?；蚩寺∷玫奶禺愋砸镆姳?。以莖用萵苣的cDNA為模板進行PCR特異性擴增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35個循環(huán)進行擴增，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定后送公司測序。

表1 所用引物

利用NCBI在線網(wǎng)站篩選同源性較高的其他物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并利用DNAMAN進行序列比對，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。利用ExPASY網(wǎng)站(http://www.expasy.org)分析轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成成分及理化性質(zhì)[23]。使用DNAMAN軟件進行氨基酸親水性與疏水性分析。使用STRING軟件進行互作網(wǎng)絡(luò)分析[24]。利用PlantCARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子存在的順式作用元件。

1.2.2 實時熒光定量PCR熒光定量PCR(qRT-PCR)采用SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)和羅氏PCR儀Roche LightCycler 96按照操作說明進行。以莖用萵苣LsTIP41(Lsat_1_v5_gn_5_116421)基因為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。利用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)的差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析

以莖用萵苣‘永安紅’品種的cDNA為模板進行克隆，得到2個約1 000 bp左右的特異性條帶，大小與預(yù)期條帶大小一致(圖1)。序列比對顯示，克隆得到的2個WRKYⅢ亞族的基因LsWRKY08和LsWRKY37分別包含945和930 bp的開放閱讀框，分別編碼314和309個氨基酸殘基(圖2)。利用DNAMAN軟件對LsWRKY08和LsWRKY37進行親水性和疏水性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2個轉(zhuǎn)錄因子均屬于親水性蛋白，其中LsWRKY08中第4位的天冬酰胺(Asn)以及LsWRKY37中第96位的賴氨酸(Lys)、97位的賴氨酸(Lys)、98位的精氨酸(Arg)親水性最高(圖3)。

M. DL2000

*表示終止密碼子

圖3 LsWRKY08和LsWRKY37轉(zhuǎn)錄因子親水性和疏水性分析

2.2 WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子序列比對以及理化性質(zhì)分析

利用NCBI網(wǎng)站對克隆得到的2個WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，LsWRKY08和LsWRKY37轉(zhuǎn)錄因子均具有WRKY保守結(jié)構(gòu)域(圖4，A)。通過Blast同源檢索發(fā)現(xiàn)，同屬于菊科的刺菜薊(Cynaracardunculus)、向日葵(Helianthusannuus)、除蟲菊(Tanaceiumcinerariifolium)等與萵苣LsWRKY08和LsWRKY37轉(zhuǎn)錄因子的相似程度較高，序列比對表明，以上物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子均有一個由60個氨基酸組成的高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域(圖4，B)。

CcWRKY70. 刺菜薊；HaWRKY. 向日葵；EcWRKY70. 加拿大飛蓬；MmWRKY. 薇甘菊；AaWRKY54. 青蒿；TcWRKY53.除蟲菊；LsWRKY. 根柳狀萵苣；EbWRKY. 熊膽草； SiWRKY53. 芝麻；VdWRKY. 常綠越橘； SsWRKY41. 一串紅；圖5同

利用ExPASY在線網(wǎng)站對上述植物的WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子進行理化性質(zhì)分析，如表2所示，各個植物WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基數(shù)在287～356之間，理論等電點在5.30～6.63之間；相對分子質(zhì)量在32.222～78.198 kD之間，其中LsWRKY08和LsWRKY37轉(zhuǎn)錄因子的相對分子質(zhì)量較大，分別為78.198和77.303 kD。堿性氨基酸的比例稍高于酸性氨基酸的比例，除部分物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子外(常綠越橘、一串紅)，差異不突出，因此以上物種的WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子既有酸性蛋白又有堿性蛋白。脂肪族氨基酸所占比例明顯高于芳香族氨基酸所占比例，蛋白質(zhì)可溶性預(yù)測中主要平均疏水特性指數(shù)(GRAVY)在-0.469～-0.887之間。

表2 不同物種WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸理化性質(zhì)分析

2.3 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子進化分析

為明確莖用萵苣LsWRKY08和LsWRKY37與其他物種的親緣關(guān)系，對不同物種的WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖5所示，莖用萵苣LsWRKY08與同屬于萵苣屬的根柳狀萵苣LsWRKY的親緣關(guān)系最近，與同屬于菊科的刺菜薊CcWRKY70、向日葵HaWRKY、加拿大飛蓬EcWRKY70等的親緣關(guān)系也比較近；同樣莖用萵苣LsWRKY37與同屬于菊科的除蟲菊TcWRKY53、熊膽草EbWRKY的親緣關(guān)系較近，而與唇形科的一串紅SsWRKY41、杜鵑花科的常綠越橘VdWRKY、胡麻科的芝麻SiWRKY53等的親緣關(guān)系較遠。

圖5 不同物種WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹

2.4 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因在萵苣不同組織及莖不同膨大期中的表達模式

qRT-PCR檢測結(jié)果(圖6)顯示，LsWRKY08在葉中表達量最高，其表達量是根和莖中的6倍；LsWRKY37在根中表達量相對較高，在莖和葉中的表達量相對較低。

不同小寫字母代表同一基因0.05水平差異顯著性，圖7同

對莖用萵苣莖不同膨大時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LsWRKY08和LsWRKY37的表達量在莖膨大時期存在差異。利用qRT-PCR對LsWRKY08和LsWRKY37在莖不同膨大期中(1、2、3 和4 cm)的表達模式檢測結(jié)果(圖7)表明，LsWRKY08的表達量在莖直徑為1 cm時最高，隨著粗度的增加，莖中的表達量逐漸下降，而LsWRKY37的表達量在莖膨大過程中表達量增加，在粗度為3 cm時表達量達到最高水平，其表達量與1 cm相比，增加了近17倍。以上結(jié)果表明，LsWRKY08在莖用萵苣莖膨大過程中可能起著負調(diào)控的作用，而LsWRKY37在莖用萵苣莖膨大過程中可能發(fā)揮著正調(diào)控的作用。

圖7 莖用萵苣2個WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因在莖膨大時期的表達模式

2.5 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因在非生物脅迫中的表達模式

為初步探究WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的功能，利用qRT-PCR分析了LsWRKY08和LsWRKY37基因在不同脅迫中的表達水平。

結(jié)果(圖8)表明：與對照相比，干旱處理過程中LsWRKY08基因表達呈波浪狀變化。在干旱處理12 h后，LsWRKY08表達量是對照的3倍，處理24 h，表達水平降低；處理48 h表達水平是對照的9倍左右。干旱處理12和24 h，LsWRKY37基因表達與對照相比沒有明顯差異，48 h后，表達水平增加，其表達量是對照的近10倍。

不同小寫字母代表同一時間不同處理0.05水平差異顯著性，圖9同

在NaCl處理12和48 h后LsWRKY08的表達水平與對照相比沒有明顯變化，而處理24 h表達水平是對照的6倍。LsWRKY37在NaCl處理24和48 h后的表達水平與對照相比明顯降低。

與對照相比，高溫處理不同時間段的LsWRKY08基因的表達水平均明顯增加，高溫處理12、24和48 h后表達量均是對照的8倍。與對照相比，LsWRKY37基因的表達水平在24 h達到最高，而在處理的其他時間段，其表達水平與對照相比均降低。

與對照相比，4 ℃低溫處理12 h后，LsWRKY08和LsWRKY37的表達量均增加，其表達量分別是對照的7倍和8倍。隨后，LsWRKY37的表達水平逐漸降低，但均高于對照；LsWRKY08的表達水平在不同處理時間段均比對照組要高。

2.6 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因在不同激素處理下的表達模式

本研究分析了2個莖用萵苣WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子基因LsWRKY08和LsWRKY37在SA、ABA、GA處理下的表達模式。如圖9所示，LsWRKY08基因在GA和SA處理不同時間段的表達量均比對照高；對于ABA處理，該基因的表達水平在處理12和48 h后比對照組增加，而處理24 h后表達量比對照要低。LsWRKY37基因在GA和ABA處理24 h表達量與對照相比明顯下降；而在SA處理24和48 h后表達量均比對照組要高。

圖9 WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子基因在不同激素處理下的表達模式

2.7 WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子的互作網(wǎng)絡(luò)分析

以模式植物擬南芥為參考，利用STRING在線網(wǎng)站分析了萵苣2個WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子LsWRKY08和LsWRKY37的互作網(wǎng)絡(luò)，以期探究其可能存在的調(diào)控機制。如圖10所示，WRKY70(LsWRKY08)和WRKY41(LsWRKY37)與多個蛋白存在著相互作用。LsWRKY08與植物防御相關(guān)蛋白PDF1.2、NPR1，NIMIN蛋白(NIMIN1、NIMIN2)，鈣調(diào)素結(jié)合蛋白SARD1，Sigma因子結(jié)合蛋白SIB1存在互作； LsWRKY08還與其他轉(zhuǎn)錄因子存在著相互作用，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子(WRKY33、WRKY40、WRKY51、WRKY54)，bZIP(AHBP-1B)。LsWRKY37與WRKY40、WRKY51等轉(zhuǎn)錄因子存在著相互作用。

圖10 WRKYⅢ轉(zhuǎn)錄因子的互作網(wǎng)絡(luò)分析

2.8 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子啟動子分析

為探究萵苣WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子基因LsWRKY08和LsWRKY37可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究利用PlantCARE網(wǎng)站分析了這2個轉(zhuǎn)錄因子起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動子序列。如圖11所示，鑒定到多個與逆境脅迫、激素響應(yīng)以及生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。LsWRKY08啟動子中含有多個與植物激素相關(guān)的順式作用元件，如生長素、MeJA、ABA、SA等；除此之外，多個MYB、ERE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及與植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，比如胚乳發(fā)育存在于LsWRKY08啟動子中。LsWRKY37啟動子含有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、MYC結(jié)合位點、ERE結(jié)合位點)，激素響應(yīng)元件(ABA、SA、MeJA)以及W-box元件。

圖11 WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子LsWRKY08和LsWRKY37啟動子順式作用元件分析

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中一個龐大的調(diào)控蛋白家族。目前，越來越多的證據(jù)表明WRKYⅢ蛋白調(diào)控鹽、干旱、高溫、低溫等多種非生物脅迫反應(yīng)。例如，在擬南芥中過表達ZmWRKY33可誘導RD29的表達從而增強轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性[25]。小麥TaWRKY75-A基因可通過參與JA信號途徑及其他代謝途徑增強對干旱及鹽脅迫的抗性[9]。同時，小麥TaWRKYⅢ-A37基因可被PEG、H2O2和ABA脅迫顯著誘導[21]。玉米WRKY40在水稻中的異源表達增強了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性[26]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與生物和非生物脅迫過程中的調(diào)控，在激素調(diào)控過程中也發(fā)揮著不可替代的作用。有研究顯示，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中可發(fā)揮激活或抑制的作用。AtWRKY39能夠參與SA和JA信號的激活過程，從而參與高溫脅迫[27]。因此，WRKY在激素信號轉(zhuǎn)導途徑中以及各種非生物脅迫條件下發(fā)揮著多重調(diào)節(jié)的作用。本研究分析了LsWRKY08和LsWRKY37基因在不同非生物脅迫、不同激素、不同植物組織以及萵苣莖不同膨大時期的表達模式。結(jié)果表明，LsWRKY08和LsWRKY37能響應(yīng)不同非生物脅迫以及激素處理，但2個基因之間表達模式存在差異。由此可見，同一亞族的轉(zhuǎn)錄因子基因功能可能存在差異，但其對于不同非生物脅迫的具體作用機制有待進一步研究。

研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子存在著自我調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可通過結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)的W-box元件調(diào)控基因表達。例如GhWRKY34可通過調(diào)節(jié)SOS1和SOS2基因的表達從而增強轉(zhuǎn)基因植株抵抗鹽脅迫的能力，AtSOS2和AtABF4的啟動子區(qū)域分別含有4個W-box順式元件和1個W-box順式元件，因此GhWRKY34可能與AtSOS2和AtABF4啟動子中的W-box順式元件結(jié)合來響應(yīng)鹽脅迫[28]。高粱SbWRKY50同樣通過直接結(jié)合SOS1和HKT1的啟動子參與鹽脅迫[29]。本研究鑒定了莖用萵苣中2個WRKYⅢ基因LsWRKY08和LsWRKY37啟動子區(qū)的順式作用元件，其中LsWRKY37啟動子含有W-box元件，表明LsWRKY37可能與其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間存在自我調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以通過與其他蛋白相互作用來調(diào)節(jié)各種生物學過程。作為植物特異轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，VQ蛋白(含有VQ基序FxxhVQxhTG)可通過與WRKY蛋白相互作用從而參與植物-生長發(fā)育或植物-逆境響應(yīng)。在響應(yīng)灰霉病菌侵染過程中，VQ蛋白SIB1、SIB2可作為WRKY33的轉(zhuǎn)錄激活劑[30]。VQ9蛋白可與WRKY8互作來調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫過程[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，LsWRKY08和LsWRKY37可與植物防御相關(guān)蛋白以及其他轉(zhuǎn)錄因子存在互作，以上結(jié)果表明LsWRKY08和LsWRKY37轉(zhuǎn)錄因子可能通過參與不同的激素信號途徑，或者與其他蛋白相互作用以及轉(zhuǎn)錄因子之間的自我調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)來等途徑來響應(yīng)非生物脅迫，但是具體的調(diào)控機制仍需進一步研究。

綜上所述，莖用萵苣2個WRKYⅢ亞族轉(zhuǎn)錄因子LsWRKY08和LsWRKY37在各種非生物脅迫，植物激素處理以及莖膨大過程中可能發(fā)揮著作用，而且不同轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控作用機制是復雜的而且存在差異的，因此對萵苣生長發(fā)育或逆境調(diào)控的作用機制也是不同的。本研究也為莖用萵苣抗逆基因的挖掘和品種改良等方面提供了重要的參考依據(jù)。