王志安，魏太平，羅曉麗，肖娟麗，劉 圓，張安紅*

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西運城 044000；2 中國科學(xué)院 微生物研究所，植物基因組國家重點實驗室，北京 100101)

棉花屬于錦葵目錦葵科棉屬植物，作為全球主要的農(nóng)作物之一，是重要的紡織和化工原料，也是重要的戰(zhàn)略物資。棉花生長和產(chǎn)量的穩(wěn)定對國民經(jīng)濟具有重要的意義[1-2]。然而，棉花在整個生長發(fā)育階段易受到多種害蟲的危害，主要包括棉鈴蟲、蚜蟲、盲蝽蟓等。研究棉花的抗蟲機制對培育抗蟲新品種具有一定的指導(dǎo)意義。

化學(xué)農(nóng)藥因防治成本低，能快速有效地控制害蟲危害，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但是大量施用化學(xué)農(nóng)藥會造成農(nóng)藥殘留，已成為農(nóng)業(yè)面源污染的重要來源之一[3-4]。同時，化學(xué)農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，降解困難，持續(xù)大劑量的應(yīng)用不僅導(dǎo)致土壤污染，也會通過飲用水或土壤-植物系統(tǒng)經(jīng)食物鏈進入人體，危害人體健康[5]。因此，選育廣譜抗蟲棉花品種是最環(huán)保和有效的手段之一，抗蟲棉花品種的選育首先需要挖掘和鑒定相應(yīng)的抗蟲基因或蛋白，故當(dāng)前克隆和分析抗蟲候選基因成為一個研究熱點。

木質(zhì)素廣泛存在于植物中，是細胞壁的重要組成部分，其重要功能主要包括木質(zhì)部導(dǎo)管運輸水分和礦物質(zhì)營養(yǎng)，以及對病原菌和昆蟲入侵的防御[6]。木質(zhì)素是植物的一種重要的次生代謝聚合物，主要由苯丙環(huán)路徑的合成代謝途徑生成，其最后一步關(guān)鍵反應(yīng)是由植物漆酶決定[7]。植物漆酶(laccase，LAC)是一種多聚氧化還原酶，屬于藍銅氧化酶家族，能夠促進木質(zhì)素單體聚合，影響植物的生長與發(fā)育，并且一些漆酶基因的表達與木質(zhì)部木質(zhì)素沉積密切相關(guān)。同時，木質(zhì)素也是植株抵御病原菌和病蟲入侵的重要屏障[8-10]。研究表明，有些LAC基因能夠被miR397調(diào)控。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)miR397可通過調(diào)節(jié)OsLAC基因影響水稻對黃蘚類固醇(BR)的敏感性反應(yīng)，增加水稻穗數(shù)。Lu等[12]發(fā)現(xiàn)ptr-miR397通過調(diào)節(jié)漆酶基因影響毛果楊木質(zhì)素含量從而影響木質(zhì)素的合成。Wang等[13]和Yamasaki等[14]研究發(fā)現(xiàn)3個漆酶基因LAC2、LAC4和LAC17有可能是擬南芥miR397的直接靶標(biāo)，并且miRNA介導(dǎo)的漆酶表達可能在木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮著重要作用。Cho等[15]研究發(fā)現(xiàn)，OsChI1基因編碼一種漆酶前體蛋白，過表達OsChI1(chitinase 1)-EGFP(enhanced green fluorescent protein)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱和鹽脅迫的耐受性增強。這些報道表明miR397與LAC一起參與木質(zhì)素合成，木質(zhì)素能夠加固植物細胞壁和導(dǎo)管，從而使植物更好地在逆境中生存。然而關(guān)于棉鈴蟲漆酶報道相對較少，相關(guān)研究證明棉鈴蟲的漆酶主要參與蟲子表皮的黑化和硬化，也有少數(shù)報道表明棉鈴蟲漆酶能夠參與對木質(zhì)素的降解作用[16-17]。

本研究分析棉花漆酶基因LAC4受miR397的調(diào)控機理，并通過表達ghr-miR397和沉默GhLAC4分析其在植物應(yīng)對棉鈴蟲中的作用。因此本研究擬闡明棉花miR397-LAC4模塊調(diào)控木質(zhì)素合成和抗蟲分子機制，為培育高抗病棉花品種提供研究基礎(chǔ)，同時也帶來許多環(huán)境、社會和經(jīng)濟利益，包括減少化學(xué)農(nóng)藥和殺蟲劑的使用、間接增加產(chǎn)量、最小化環(huán)境污染以及減少勞動力和成本。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

經(jīng)硫酸脫絨過的棉花種子浸泡在水中，37 ℃培養(yǎng)箱過夜后放至培養(yǎng)盒中，保持種子濕潤情況下黑暗處萌芽。取發(fā)芽一致的種子轉(zhuǎn)至Hoaglands培養(yǎng)盒中或種植到營養(yǎng)土中，于室溫28 ℃、16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 植物組織RNA的提取和實時定量PCR取棉花組織的樣品于滅菌的研缽中加入液氮迅速研磨，待樣品磨碎后分裝于無酶離心管中，隨后使用Trizol試劑從棉花植物中提取總RNA，通過使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京擎科生物有限公司)將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。mRNA引物設(shè)計、第一鏈cDNA合成分析均參照Varkonyi-Gasic等方法[18]。qPCR實驗則根據(jù)2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)試劑盒使用說明(北京擎科生物有限公司)進行操作，來自棉花的U6和UBQ7基因用作棉花miRNA和其他基因標(biāo)準(zhǔn)對照。最后使用2-ΔΔCT方法來確定相對表達水平。

1.2.2 載體構(gòu)建煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)相關(guān)的載體構(gòu)建可參照Liu等[19]和Sha等[20]文獻。為了構(gòu)建ghr-miR397沉默的棉花植物的載體，設(shè)計一個小串聯(lián)靶模擬(short tandem mimicry technology，STTM)序列，其中包含一段48 nt序列，兩端連接兩段短的重復(fù)序列模擬靶標(biāo)，其5′和3′端酶切位點分別為XbaⅠ和BamHⅠ，插入到pTRV2e載體中生成TRV:STTM397載體。從棉花基因組中克隆棉花miR397基因并插入pTRV2e載體，構(gòu)建TRV:OE-miR397載體，生成TRV-miR397過表達的棉花植物。VIGS載體構(gòu)建可參照Pang等[21]文獻。為了獲得VIGS技術(shù)沉默GhLAC4基因的植株，選用GhLAC4(Gh-A03G0417)基因特異性片段，設(shè)計正反向引物，并在引物兩端分別加上KpnⅠ、BamHⅠ酶切位點，插入到pTRV2載體中，構(gòu)建沉默GhLAC4載體，所以質(zhì)粒均需電轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽性克隆，將陽性菌液擴繁。用甘油(50%)保存后放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將GhLAC4和GhLAC4突變體(GhLAC4mu，ghr-miR397靶序列突變)與pBI121載體的GUS基因融合，分別得到GhLAC4:GUS和GhLAC4mu:GUS載體。將miR397的前體序列插入pCAMBIA1300中，在35S啟動子的驅(qū)動下生成pCAMBIA1300-miR397。所有的質(zhì)粒采用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。將含有上述載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)在含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL慶大霉素和50 μg/mL利福平的LB培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)過夜。收集農(nóng)桿菌細胞，在MMA溶液(10 mmol/L 2-嗎啉乙醇磺酸、10 mmol/L氯化鎂和200 mmol/L乙酰丁香酮、OD600為1.2)中重懸。將含有上述載體的農(nóng)桿菌細胞與pYL192均勻混合，在室溫黑暗中孵育2 h。最后，參照Tang等[22]所述，對植物進行農(nóng)桿菌滲透。所有與載體構(gòu)建相關(guān)的引物均列于表1。

表1 研究中涉及到的引物

1.2.3 棉花組織化學(xué)染色為觀察木質(zhì)部發(fā)育和木質(zhì)素沉積，采用Wiesner reagent進行組織化學(xué)染色[23]。手工將3個以上的棉花第一節(jié)間切片，厚度小于0.3 cm，選擇較為完整一致的切片加入1%間苯三酚染色液處理10 min，清除間苯三酚液體后加18%鹽酸處理20 min，用體式顯微鏡(DM2500；徠卡，德國)觀察和拍照。

1.2.4 木質(zhì)素含量測定采用Klason法[24]測定不同處理下植物的第一個節(jié)間的木質(zhì)素含量。剪取植株第一節(jié)間于液氮下研磨，取400 mg樣品放在50 mL無酶EP管中，加45 mL甲醇，于200 r/min搖床振蕩過夜，次日于6 000 r/min離心10 min后去除上清；重復(fù)上述步驟，振蕩2 h即可；將得到的樣品在80 ℃下烘干，樣品重量約200 mg(A1)，加入4 mL的72% H2SO4，于30 ℃ 水浴下1 h；轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中加112 mL蒸餾水，95 ℃ 水浴1 h，水浴期間維持水位刻度線，補充水；將濾紙烘干稱重(A2)，過濾上述水浴樣品烘干稱重(A3)。木質(zhì)素含量=(A3-A2)/A1×100%。該實驗3次重復(fù)。

1.2.5 棉鈴蟲的選擇性和非選擇性取食實驗1)非選擇性實驗。通過測定棉鈴蟲幼蟲在GhLAC4沉默植株(TRV:GhLAC4)、miR397過表達植株(TRV:OE-miR397)、miR397沉默植株TRV:STTM397和對照植株(利用空載體進行進行沉默表示為TRV:00)上取食48 h后的體重增長情況，以反映棉花植株對棉鈴蟲的抗性。具體方法：選取生長發(fā)育和體重一致的2日齡棉鈴蟲，置于棉花植株葉片上，取食48 h后取下棉花上的棉鈴蟲，用天平稱重。

2)選擇性實驗。為觀察不同處理棉花材料對棉鈴蟲的抗性，測試棉鈴蟲取食偏好性，分別將65只生長發(fā)育和體重一致的2日齡棉鈴蟲，TRV:GhLAC4、TRV:OE-miR397、TRV:STTM397和對照植株放入透明的容器內(nèi)且避光，觀察棉鈴蟲的取食偏好性，48 h后取下棉花上的棉鈴蟲，用天平稱重，且統(tǒng)計葉片的取食面積和蟲子數(shù)量[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhLAC4基因調(diào)控棉花對棉鈴蟲的抗性分析

為了研究GhLAC4的抗蟲功能與棉花植株木質(zhì)素合成積累的關(guān)系，利用煙草TRV沉默系統(tǒng)構(gòu)建沉默GhLAC4載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，注射棉花子葉，培育GhLAC4沉默植株(TRV:GhLAC4)。對這些棉株的莖稈切片進行間苯三酚-HCl染色反應(yīng)(酸性條件下間苯三酚與木質(zhì)素發(fā)生反應(yīng)，木質(zhì)部變成紅紫色)，觀察切片木質(zhì)部顏色情況。結(jié)果顯示：TRV:GhLAC4植株比TRV:00植株著色淺，表明沉默GhLAC4基因會減少木質(zhì)素積累(圖1，A)。利用Klason法測定植株的木質(zhì)素含量，相較于對照植株，GhLAC4沉默植株的木質(zhì)素含量顯著減少(圖1，B)。這些結(jié)果暗示GhLAC4沉默植株，由于GhLAC4基因沉默其木質(zhì)素含量減少。

A.植株中莖切片的間苯三酚-HCL染色圖，黑色箭頭示紅色方框木質(zhì)部的放大區(qū)域，標(biāo)尺=350 μm；B.棉株木質(zhì)素含量測定；C、D.棉鈴蟲葉片取食面積及48 h后統(tǒng)計；E.棉鈴蟲取食后重量統(tǒng)計；平均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)誤)來自于3個生物學(xué)重復(fù)，**表示處理組植株和對照組植株有顯著性差異(**P < 0.01)

為了驗證GhLAC4沉默植株的棉鈴蟲抗性減弱，進行了非選擇性棉鈴蟲實驗。結(jié)果顯示，接種棉鈴蟲48 h后統(tǒng)計棉花葉片的取食面積，GhLAC4沉默植株的取食面積顯著高于對照植株的取食面積(圖1，C、D)。統(tǒng)計接種棉鈴蟲24 和48 h后棉鈴蟲重量(圖1，E)，結(jié)果顯示，取食GhLAC4沉默植株的棉鈴蟲重量明顯高于對照植株。綜合認為，GhLAC4沉默植株的木質(zhì)素含量減少，降低了棉花對棉鈴蟲的抗性，表明GhLAC4正調(diào)控棉花對棉鈴蟲的抗性。

2.2 ghr-miR397調(diào)控棉花對棉鈴蟲的抗性分析

為進一步研究ghr-miR397在陸地棉中的抗蟲功能，利用TRV沉默系統(tǒng)和STTM技術(shù)構(gòu)建沉默ghr-miR397載體和過表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，注射棉花子葉，培育ghr-miR397沉默植株(TRV:STTM397)和過表達植株(TRV:OE-miR397)。間苯三酚染色結(jié)果表明，與棉花對照植株TRV:00相比，棉花TRV:OE-miR397植株木質(zhì)部的染色較淺，而TRV:STTM397染色明顯，顏色更深(圖2，A)。Klason法檢測的棉花TRV:OE-miR397植株中的木質(zhì)素含量顯著低于TRV:00棉花植株，而TRV:STTM397棉花植株中的木質(zhì)素含量顯著高于TRV:00棉花植株(圖2，B)。由此說明，過量表達miR397可以減少棉花植株木質(zhì)素積累，而沉默miR397增加木質(zhì)素積累。

為探究ghr-miR397過表達和沉默植株的木質(zhì)素合成和積累對植株抗蟲功能的影響，對TRV:OE-miR397和TRV:STTM397植株進行了棉鈴蟲抗性測定。棉鈴蟲非選擇性實驗表明，ghr-miR397過表達植株對棉鈴蟲抗性減弱，而ghr-miR397沉默植株對棉鈴蟲抗性增強。接種棉鈴蟲48 h后棉花葉片被食面積統(tǒng)計，ghr-miR397過表達植株棉鈴蟲取食面積明顯大于對照植株。而ghr-miR397沉默植株棉鈴蟲取食面積明顯小于對照植株(圖2，C、D)。這可能與不同處理下植株的木質(zhì)素積累有關(guān)。取食棉花葉片24和48 h后棉鈴蟲重量統(tǒng)計顯示，ghr-miR397過表達植株棉鈴蟲顯著重于對照植株，而ghr-miR397沉默植株棉鈴蟲顯著輕于對照植株(圖2，E)。

A.棉花莖稈切片間苯三酚-HCL染色，黑色箭頭示紅色方框木質(zhì)部的放大區(qū)域，標(biāo)尺=350 μm；B.棉花植株木質(zhì)素含量測定；C、D.棉鈴蟲葉片取食面積及48 h后統(tǒng)計；E.棉鈴蟲取食后重量統(tǒng)計；平均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)誤)來自于3個生物學(xué)重復(fù)；B、D圖中，*和**表示處理組植株和對照組植株有顯著性差異(*P < 0.05, **P < 0.01)，E圖中，不同小寫字母表示差異顯著性(P < 0.05)

2.3 棉花miR397-LAC4調(diào)控植株抗蟲性分析

為了進一步探究miR397-LAC4對棉鈴蟲的抗性，進行選擇性實驗以檢測棉鈴蟲對不同處理植株的取食偏好性。結(jié)果顯示，棉花葉片接種棉鈴蟲48 h后，棉鈴蟲更偏向取食GhLAC4沉默植株和ghr-miR397過表達植株，其次是對照植株，最后才是ghr-miR397沉默植株(圖3，A)。接種48 h后統(tǒng)計棉花葉片的取食面積，GhLAC4沉默植株和ghr-miR397過表達植株棉鈴蟲取食面積明顯大于對照植株，而棉鈴蟲取食來源于ghr-miR397沉默材料葉片的面積大于對照植株(圖3，B)。接種棉鈴蟲后12、24和48 h不同處理植株葉片上棉鈴蟲個數(shù)統(tǒng)計也與上述結(jié)果相一致(圖3，C)。因此，沉默GhLAC4和過表達ghr-miR397降低棉花的木質(zhì)化作用，降低其對生物脅迫的耐受性。而沉默ghr-miR397棉花植株細胞壁的木質(zhì)化增強、木質(zhì)素含量增加，提高了棉花植株對棉鈴蟲的抗性。

A.棉鈴蟲取食情況；B棉鈴蟲取食面積(48 h后)統(tǒng)計；C.棉鈴蟲取食后重量統(tǒng)計；平均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)誤)來自于3個生物學(xué)重復(fù)，不同小寫字母表示差異顯著性(P < 0.05)

3 討 論

目前用于生產(chǎn)棉花的抗蟲轉(zhuǎn)基因大多數(shù)為Cry1Ab和Cry1Ac，抗性基因品種單一，容易使害蟲產(chǎn)生抗性[26]。近年來，相關(guān)研究分離出對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有殺蟲效果的基因，但是多集中在基因的克隆和功能分析階段[27]，也有研究證實了Vip3A和轉(zhuǎn)Bt基因能夠在棉花植株內(nèi)表達，并且具有很好的抗蟲效果[28-29]。鑒于此相關(guān)研究表明植物木質(zhì)素通過漆酶聚合單醇沉積在細胞壁中[30]。通過基因?qū)嶒瀳蟮溃?7個漆酶基因中只有4個在擬南芥的木質(zhì)素生物合成中起作用。此外，木質(zhì)素可作為防止致病性入侵和增強植物抗性的屏障[31]。然而，LAC家族基因參與木質(zhì)素生物合成和植物抗性的功能尚未在miRNA的遺傳分析和調(diào)控中得到探索。在這里，我們描述了棉花LAC4通過調(diào)節(jié)miR397和參與植物防御在木質(zhì)素生物合成中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)GhLAC4在木質(zhì)素的生物合成中起作用。通過木質(zhì)素含量測定、化學(xué)染色，GhLAC4的植株木質(zhì)素含量較低。雖然植物中有許多LACs，但只有少數(shù)參與單酚聚合為木質(zhì)素。例如，在擬南芥的17個漆酶基因中，根據(jù)遺傳分析證實，只有LAC4、LAC11、LAC15和LAC17在木質(zhì)素生物合成中起作用[32]。在害蟲的入侵作用下，GhLAC4的表達水平升高，而ghr-miR397的積累減少，導(dǎo)致植物抗性增強。越來越多的證據(jù)表明，一些植物L(fēng)ACs，包括參與基礎(chǔ)木質(zhì)素生物合成的LACs，對蟲害入侵作出反應(yīng)，增加細胞壁木質(zhì)化，導(dǎo)致植物防御增加[7]。過表達GhLAC15可以增加植物細胞壁的木質(zhì)化和木質(zhì)素含量，從而提高植物對棉鈴蟲的抗性[10]。因此，本研究利用ghr-miR397-GhLAC4模塊基因獲得了高抗棉鈴蟲棉花材料，在靜息狀態(tài)下，GhLAC4通常作用于木質(zhì)素生物合成，木質(zhì)素生物合成沉積在細胞壁中促進植物生長發(fā)育，可以為棉花抗蟲育種提供新的種質(zhì)。