郭玉玉，余 宋，翟笑楓

（解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海 200083）

食管癌（esophageal cancer）是世界上最常見(jiàn)和致命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別排名第7 位和第6 位。該疾病病理類(lèi)型主要分為鱗癌和腺癌，不同病理類(lèi)型的食管癌流行病學(xué)分布明顯不同，在歐洲以及北美地區(qū)，食管腺癌發(fā)病率偏高；在東亞、非洲東部以及南歐以食管鱗癌為主。我國(guó)食管癌以食管鱗癌為主，發(fā)病率居世界前5 名[1]。目前普遍認(rèn)為影響食管癌患者預(yù)后的因素主要分為腫瘤的分期分級(jí)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及對(duì)患者治療后的反應(yīng)。CT 等影像學(xué)方法在腫瘤患者管理中具有較多局限性，存在輻射暴露的風(fēng)險(xiǎn)、不能頻繁檢測(cè)、假陽(yáng)性較高等問(wèn)題，一般治療較長(zhǎng)的一段時(shí)間后才能進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，且只能評(píng)估可測(cè)量的病變等[2]。雖然CEA、CA199、NSE 等腫瘤標(biāo)志物，能夠無(wú)創(chuàng)、安全、頻繁、實(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但其特異性和靈敏度欠佳，且其含量的變化無(wú)法反饋腫瘤反應(yīng)或進(jìn)展[3]。近年臨床提出了液體活檢的概念，最初主要指循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的分析，現(xiàn)在擴(kuò)展到分析腫瘤在體液（主要是血液）中釋放的腫瘤成分，包括無(wú)細(xì)胞循環(huán)核酸（DNA、mRNA、非編碼RNA）等[4，5]，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的診斷及預(yù)后。本文將從食管癌的早期診斷、臨床分期及預(yù)后等方面對(duì)循環(huán)腫瘤DNA 的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要概述。

1 ctDNA 概述

游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細(xì)胞外DNA，來(lái)源于正常細(xì)胞和凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞，而循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是其中的一部分，既攜帶腫瘤細(xì)胞的基本遺傳信息，又?jǐn)y帶基因突變后的信息，包含點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增甚至基因拷貝數(shù)變異[6]，尿液、腦脊液、胸液、腹水和唾液中均可檢測(cè)到ctDNA 的存在，其來(lái)源于壞死的腫瘤細(xì)胞、凋亡的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[7]。在性質(zhì)上，ctDNA 通常長(zhǎng)度為160～180 bp，在血液中含量極低，約占所有cfDNA的0.01%～1%，其含量與腫瘤的類(lèi)型、腫瘤負(fù)荷、疾病進(jìn)展程度有關(guān)[8]。由于ctDNA 來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，并且半衰期短，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的演變過(guò)程。

1948 年Mandel 和Metais 首次報(bào)道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA 已成為許多醫(yī)學(xué)學(xué)科的熱門(mén)研究領(lǐng)域[9]。通過(guò)測(cè)量ctDNA 等位基因突變片段可以獲得定量信息，用于腫瘤診斷并反映腫瘤負(fù)荷情況。李紅[10]研究表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血ctDNA 水平與腫瘤臨床特征、患者疾病健康史無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，首程化療前后血漿中ctDNA 水平對(duì)患者短期療效轉(zhuǎn)歸具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值；對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者ErbB 信號(hào)通路乳腺癌相關(guān)基因進(jìn)行定性和定量研究對(duì)判斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后提供重要依據(jù)。Chae YK 等[11]回顧性分析了136 例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度的ctDNA 與較短的PFS 和總生存期（overall survival，OS）有關(guān)。

2 ctDNA 在食管癌患者中的應(yīng)用

2.1 用于食管癌的早期診斷與臨床分期 腫瘤早期發(fā)現(xiàn)是減少腫瘤相關(guān)死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。早期食管癌沒(méi)有特異性臨床癥狀，確診時(shí)多處于中晚期。但ctDNA 的異常在腫瘤發(fā)生的早期則可檢測(cè)到。基因測(cè)序研究顯示[12]，食管鱗癌的基因突變已在多個(gè)基因中得到驗(yàn)證，包括TP53、CDKN2A、FAT1、NOTCH1、PIK3CA、KMT2D 和NFE2L2。Talukdar FR等[13]對(duì)比分析了227 例食管鱗癌患者的正常組織、單純?cè)錾慕M織、上皮內(nèi)瘤變，并對(duì)組織樣本進(jìn)行了全基因組、外顯子組或靶向序列分析，結(jié)果得出食管上皮內(nèi)瘤變和ESCC 組織具有相似的突變和拷貝數(shù)變化，頻率相似。啟動(dòng)子高甲基化是一種腫瘤特異的表觀(guān)遺傳異常，發(fā)生速度高于突變，針對(duì)DNA 甲基化的ctDNA 檢測(cè)技術(shù)也適用于早期癌癥檢測(cè)和篩查[14]。Li X 等[4]研究提示，腫瘤組織中epb41l3、gpx3 和col14a1 的甲基化頻率高于正常周?chē)M織，并且epb41l3、gpx3 和col14a1 基因的甲基化僅在食管鱗癌患者的血漿中發(fā)現(xiàn)。5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是DNA 主動(dòng)去甲基化的中間產(chǎn)物，是一種新的腫瘤表觀(guān)遺傳學(xué)標(biāo)志物。研究表明[15]，5hmC 用于診斷食管癌的敏感度為93.75%，特異度為85.71%，可作為食管癌微創(chuàng)診斷的生物標(biāo)志物。來(lái)自我國(guó)的一項(xiàng)研究采集了臺(tái)州1156 份健康人群血漿樣本進(jìn)行癌癥篩查，對(duì)樣本血液中ctDNA 甲基化測(cè)序，并進(jìn)行回顧性分析，共有575 名最初健康的研究參與者在4年內(nèi)被診斷出患有結(jié)直腸癌、食道癌、肝癌、肺癌或胃癌，總體敏感性為95%，其中食管癌敏感度為91%，表明ctDNA 檢測(cè)比傳統(tǒng)方法可以更早的預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)生[16]。

此外，微衛(wèi)星改變也可以從食管鱗癌患者的血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)。Eisenberger CF 等[17]檢測(cè)了食管癌患者的腫瘤及血清中微衛(wèi)星情況，并以健康個(gè)體作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)92.9%的食管鱗癌患者原發(fā)腫瘤中有1 個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星DNA 改變，96.4%的患者血清中至少有1 個(gè)微衛(wèi)星DNA 變化，而健康人對(duì)照者血清DNA 中均未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星改變，提示血清微衛(wèi)星DNA 分析也是檢測(cè)食管鱗癌的一個(gè)具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道[18-20]，根據(jù)檢測(cè)到的CTCs 和ctDNA 作為食管癌的臨床分期依據(jù)，與經(jīng)典的腫瘤TNM 分期之間存在著明顯的相關(guān)性，因此建議將CTCs 和ctDNA 的檢測(cè)作為臨床腫瘤分期的重要組成部分，但是其可行性仍需要進(jìn)一步評(píng)估。

2.2 用于食管癌的早期治療 食管癌僅需接受單純的手術(shù)或者放療，而中晚期食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為同步放、化療或者免疫治療。研究表明[21]，食管腺癌患者ctDNA 數(shù)量和突變頻率均隨腫瘤分期增加而增加，并可在臨床或影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展前檢測(cè)到ctDNA 水平變化。因此，對(duì)于臨床分期為早期但伴有ctDNA 數(shù)量或頻率增加的患者，給予更積極的治療或可改善這部分患者的預(yù)后。晚期轉(zhuǎn)移性食管癌患者通常會(huì)接受全身藥物治療。有研究顯示[22]，上消化道腫瘤患者的不同轉(zhuǎn)移病灶和原發(fā)腫瘤間的MET 基因擴(kuò)增具有顯著的異質(zhì)性。單病灶活檢的分子譜不足以指導(dǎo)靶向治療藥物的選擇。ctDNA 來(lái)源于全身腫瘤，能克服腫瘤區(qū)域異質(zhì)性問(wèn)題，較全面地反映腫瘤基因全貌。Petty RD 等[23]設(shè)計(jì)了一項(xiàng)多中心前瞻性雙盲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療的EGFR 擴(kuò)增食管癌患者與安慰劑組相比，其總體生存率顯著提高，但在EGFR 陰性食管癌患者中，吉非替尼組與安慰劑組相比總體生存率并沒(méi)有顯著差異。相關(guān)研究證實(shí)[24]，血漿ctDNA 中EGFR 的突變狀態(tài)與相應(yīng)的腫瘤組織相一致，提示可以使用血漿ctDNA 替代組織來(lái)評(píng)估EGFR 突變狀態(tài)，篩選出適合接受吉非替尼治療的患者。值得注意的是，食管鱗癌和食管腺癌在發(fā)病機(jī)制上顯著不同，也具有明顯不一樣的分子特征。食管鱗癌表現(xiàn)出頻繁的CCND1、NOTCH1、SOX2 和/或TP63 的基因組擴(kuò)增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4 和GATA6 基因改變則在食管腺癌中更為常見(jiàn)[25，26]，因此應(yīng)慎重對(duì)待文獻(xiàn)中關(guān)于食管癌藥物治療的相關(guān)結(jié)論。

2.3 用于食管癌的預(yù)后評(píng)估 早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于復(fù)發(fā)后早期干預(yù)和延長(zhǎng)患者生存至關(guān)重要。在進(jìn)行根治性手術(shù)或者放化療后，有相當(dāng)一部分患者存在隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD），而治療后MRD 持續(xù)存在成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在來(lái)源[27]。ctDNA 具有監(jiān)測(cè)隱匿性腫瘤和追蹤腫瘤特異性突變的潛在能力，適合于MRD 的評(píng)估。目前，基于ctDNA 檢測(cè)的液體活檢技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病MRD 的監(jiān)測(cè)。在食管癌等實(shí)體腫瘤中，ctDNA 濃度低，MRD 監(jiān)測(cè)仍然具有挑戰(zhàn)性。Luo H 等[28]通過(guò)對(duì)ESCC 組織、癌旁組織和正常組織以及手術(shù)前和手術(shù)后的血漿進(jìn)行測(cè)序，分析了ctDNA 在ESCC 中的特異性和作用，結(jié)果證明利用ctDNA 檢測(cè)ESCC 和監(jiān)測(cè)治療效果具有可行性。Azad T 等[8]通過(guò)對(duì)食管癌患者放化療前后及健康對(duì)照組血液的DNA 進(jìn)行腫瘤個(gè)性化深度測(cè)序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），發(fā)現(xiàn)放化療后ctDNA 的檢出率與腫瘤進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較短的生存期有關(guān)，提示ctDNA可反映食管癌相關(guān)的基因信息，并與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為反映食管癌治療效果及預(yù)后的生物標(biāo)志物。在過(guò)去的幾年里，腫瘤特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)取得了很大的進(jìn)展，DDPCR、下一代測(cè)序（NGS）等實(shí)時(shí)、高度靈敏的液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)使得識(shí)別MRD 以及對(duì)罕見(jiàn)基因突變、基因甲基化序列的監(jiān)測(cè)成為可能[29]。通過(guò)對(duì)接受根治性手術(shù)以及放化療癌癥患者，對(duì)比治療前后ctDNA 水平的含量，能夠有效地判斷體內(nèi)是否還存在著影像學(xué)或病理檢查無(wú)法確認(rèn)的微小殘留灶，從而能夠有效地指導(dǎo)后續(xù)抗復(fù)發(fā)治療方案。研究顯示[30]，術(shù)后ctDNA的濃度與患者生存率呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)腫瘤患者進(jìn)行連續(xù)ctDNA 檢測(cè)可以反映癌癥進(jìn)展和治療耐藥性的發(fā)生。

3 總結(jié)

液體活檢已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。ctDNA 是血液中來(lái)自腫瘤的游離DNA。由于ctDNA 來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，并且半衰期短，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的演變過(guò)程。但ctDNA 在食管癌的臨床應(yīng)用仍存在諸多挑戰(zhàn)，如ctDNA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化、敏感性仍有欠缺，尤其對(duì)ctDNA 水平較低者，同一血液樣本采用不同測(cè)序方法的檢測(cè)結(jié)果也存在差異?？傊簯B(tài)活檢技術(shù)作為腫瘤診斷的新技術(shù)，除了可以獲取腫瘤相關(guān)分子信息，還可以低創(chuàng)動(dòng)態(tài)地對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷，幫助臨床醫(yī)師及時(shí)調(diào)整治療方案，并進(jìn)一步研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，且有助于靶向藥物的研發(fā)。