徐浩然，喬溪瑩，2a，張童畫，于庚原，畢玥琳，馮欣，韋坤益，孫毅坤*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬護(hù)國寺中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035

刺梨葉又稱繅絲花葉，是薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.及單瓣繅絲花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥葉，主產(chǎn)地為貴州，為貴州苗族等少數(shù)民族用藥。刺梨葉味甘、酸澀，歸脾、腎、胃經(jīng)，具有消食化積的功效，主治食積、疥痛、破傷風(fēng)等癥，是小兒消食開胃顆粒和消痞和胃膠囊的組成藥味之一[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，刺梨葉中含有黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、多酚、三萜、植物甾醇和維生素C 等多種化學(xué)物質(zhì)[3-4]。但是，有關(guān)刺梨葉化學(xué)成分全面分析鑒定的研究鮮有報道。因此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）對刺梨葉中的化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒定研究，為刺梨葉后續(xù)藥理作用研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CPA225D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（北京五洲東方科技有限公司）；U3000型超高效液相色譜、QExactive 型質(zhì)譜儀[美國Thermo Fisher Scientific 公司，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 3.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]。

1.2 試藥

刺梨葉（批號：20190302，貴州永樂藥業(yè)有限公司）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫毅坤教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.及單瓣繅絲花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥葉，陰干，粉碎，備用；水為超純水；甲醇、乙腈和甲酸為質(zhì)譜級（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取刺梨葉粉末3.00 g 置于100 mL 具塞錐形瓶中，按照料液比1∶10 精密加入75%甲醇30.0 mL，搖勻，水浴加熱回流2 h，取出靜置放冷，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液做進(jìn)一步分析。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters UPLC C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，5%B；2～17 min，5%～98%B；17～20 min，98%B；20～23 min，98%～5%B；23～25 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為ESI；在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，掃描方式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full scan/ddMS2），掃描范圍為m/z100～1200；毛細(xì)管溫度為350 ℃；負(fù)離子模式下噴霧電壓為3800 V，正離子模式下噴霧電壓為3200 V；鞘氣流速為35 arb；輔助氣流速為15 arb；MS2采用低、中、高3 種碰撞能，正離子模式下碰撞能分別為30、40、50 eV，負(fù)離子模式下碰撞能分別為30、50、70 eV；一級質(zhì)譜分辨率為Full Scan 70 000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二級質(zhì)譜分辨率為MS/MS 17 500 FWHM。

2.4 化學(xué)成分檢測與分析

取2.1 項下供試品溶液5 μL，按照2.2 項下色譜條件及2.3 項下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，采用檢測得到刺梨葉化學(xué)成分的m/z和保留時間（tR）等質(zhì)譜信息。使用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，通過高分辨率質(zhì)譜信息推導(dǎo)其可能的分子式，質(zhì)譜偏差（δ）≤5×10-6。分析正、負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及二級質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及化合物裂解規(guī)律共鑒定化學(xué)成分。

3 結(jié)果與分析

3.1 刺梨葉化學(xué)成分分析

根據(jù)正、負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰及二級質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)及化合物裂解規(guī)律共鑒定出刺梨葉中57 個化學(xué)成分。ESI+和ESI-模式下刺梨葉的基峰離子流（BPI）色譜圖見圖1～2，鑒定結(jié)果見表1。

表1 刺梨葉中化學(xué)成分鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 ESI+模式下刺梨葉的BPI圖

圖2 ESI-模式下刺梨葉的BPI圖

3.2 裂解規(guī)律推導(dǎo)

3.2.1 黃酮類成分分析 從刺梨葉中共鑒定出21個黃酮類化合物。黃酮類化合物泛指2 個苯環(huán)通過中央3 個碳原子互相連接而成的具有C6-C3-C6基本骨架的化合物在其A 環(huán)和B 環(huán)上常連接甲基或者甲氧基等官能團(tuán)，并且常與糖結(jié)合成苷。黃酮類化合物的主要裂解方式以糖苷鍵斷裂，狄爾斯-阿爾德（RDA）反應(yīng)裂解，CO2、CO等中性離子丟失為主。

化合物11的tR為1.16 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z289.070 7 [M-H]-，推斷其分子式為C15H14O6；二級質(zhì)譜圖中母離子失去1 分子H2O 得到m/z271.061 6離子，失去1分子CO2得到m/z245.082 1離子，在C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解生成m/z137.023 5 的離子碎片，結(jié)合負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子及特征碎片離子信息，比對相關(guān)文獻(xiàn)可確定該化合物為黃酮類化合物兒茶素[2,8-9]，其二級質(zhì)譜圖見圖3，特征裂解規(guī)律見圖4。

圖3 兒茶素的二級質(zhì)譜圖

圖4 兒茶素的質(zhì)譜裂解規(guī)律

化合物25的tR為5.34 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z577.135 7[M-H]-，即原花青素B2的C 環(huán)經(jīng)RDA 裂解失去C8H8O3后再失去1 分子H2O 得到二級碎片m/z407.077 9[M-H-C8H8O3-H2O]-，以及化學(xué)鍵斷裂后得到m/z289.072 3 [M-H-C15H12O6]-、m/z205.050 3[M-H-C15H12O6-2（C2H2O）]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再比對相關(guān)文獻(xiàn)[16]可確定該化合物是黃酮類化合物原花青素B2。其二級質(zhì)譜圖見圖5，裂解規(guī)律見圖6。

圖5 原花青素B2的二級質(zhì)譜圖

圖6 原花青素B2的質(zhì)譜裂解途徑

化合物35的tR為6.98 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z593.152 0 [M-H]-，同時可以觀察m/z285.040 6[M-H-C11H20O6]-、m/z255.030 0[M-HC11H20O6-CH2O]-、m/z227.035 0[M-H-C11H20O6-CH2O-CO]-、m/z163.039 4[M-H-C21H18O10]-、m/z145.028 6[M-H-C21H20O11]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]可確定該化合物是黃酮類化合物忍冬苷。其二級質(zhì)譜圖見圖7，裂解規(guī)律見圖8。

圖7 忍冬苷的二級質(zhì)譜圖

圖8 忍冬苷的質(zhì)譜裂解途徑

3.2.2 有機(jī)酸類成分解析 以化合物24為例，其tR為4.63 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z353.088 1[MH]-，同時二級裂解圖譜可見m/z191.055 7[M-HC9H6O3]-、m/z179.034 4[M-H-C7H10O5]-的碎片離子，提示酰氧鍵產(chǎn)生了斷裂，產(chǎn)生了奎寧酸和咖啡酸的碎片，2個碎片隨后發(fā)生進(jìn)一步裂解失去H2O或CO2產(chǎn)生了m/z173.044 9[M-H-C9H6O3-H2O]-、m/z155.034 0[M-H-C9H6O3-2H2O]-、m/z137.023 7[M-H-C9H6O3-3H2O]-、m/z179.034 4[M-HC7H10O5]-、m/z161.023 8[M-H-C7H10O5-H2O]-、m/z135.044 3 [M-H-C9H6O3-CO2]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再比對相關(guān)文獻(xiàn)可確定該化合物為有機(jī)酸類化合物綠原酸[8,15]，其二級質(zhì)譜圖見圖9，裂解規(guī)律見圖10。

圖9 綠原酸的二級質(zhì)譜圖

圖10 綠原酸的裂解途徑

3.2.3 三萜類成分分析 在刺梨葉中共鑒定出3 個三萜類成分，包括刺梨苷、薔薇酸（野鴉椿酸）、委陵菜酸。以化合物47 為例，其tR為9.56 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z649.396 4[M-H]-，同時可以觀察到明顯的m/z487.343 9 [M-H-C6H9O5]-、m/z469.332 3 [M -H -C6H9O5-H2O]-、m/z457.337 8[M-H-C6H9O5-CH2O]-、m/z441.341 1[M-H-C6H9O5-H2O-CO]-、m/z425.342 8 [MH-C6H9O5-H2O-CO2]-、m/z407.333 3 [M-HC6H9O5-H2O-CO2-H2O]-等的特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和特征碎片，推測該化合物是三萜類化合物刺梨苷。其二級質(zhì)譜圖見圖11，裂解規(guī)律見圖12。

圖11 刺梨苷的二級質(zhì)譜圖

圖12 刺梨苷的質(zhì)譜裂解途徑

4 討論

本研究建立的UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地鑒定刺梨葉中的化學(xué)成分，共鑒定化合物57 個，包括黃酮類21 個、氨基酸類12個、有機(jī)酸類10 個、多酚類5 個、三萜類3 個、植物甾醇類2 個、蒽醌類1 個、四環(huán)二萜類1 個、香豆素類1個及其他類化合物1個。基于三萜類成分在所鑒定化合物中響應(yīng)較好且具有一定藥理作用，同時參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物選取原則[30]，對刺梨葉中代表性三萜類化合物刺梨苷進(jìn)行了裂解規(guī)律推導(dǎo)，為刺梨葉藥效機(jī)制、體內(nèi)代謝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

本研究前期考察了提取溶劑（水、50%甲醇、75% 甲醇、甲醇）、提取時間（1.0、1.5、2.0、3.0 h）、稀釋倍數(shù)（5、10、15 倍），對提取方法進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，采用75%甲醇水浴回流2 h提取、稀釋10 倍進(jìn)樣，得到的色譜峰信息較多，各分析物響應(yīng)也較好。

通過對比分析刺梨葉同科植物成分分析的研究可知，在薔薇科大部分藥用植物中均含有黃酮、三萜及有機(jī)酸類成分。例如，刺玫果為薔薇科薔薇屬植物山刺玫R.davuricaPall.的干燥成熟果實(shí)，主要含有蘆丁、金絲桃苷、橙皮苷、槲皮素等黃酮類物質(zhì)，其中黃酮類化合物含量相對較高[31]。徐艷春等[32]發(fā)現(xiàn)同為薔薇科薔薇屬的植物金櫻子中含有鞣質(zhì)、皂苷、三萜等多種化合物，其中三萜類成分的含量很高，并且具有一定的藥理作用，故建議將其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。薔薇科植物山楂中含有多種有機(jī)酸類成分，謝穎等[33]建立了基于蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的高效液相色譜法（HPLC），對山楂中的熊果酸和齊墩果酸進(jìn)行了含量測定。有研究發(fā)現(xiàn)薔薇科植物的果實(shí)常具有“酸”的藥性，如刺梨果、烏梅、金櫻子和覆盆子等，而有機(jī)酸類成分常被認(rèn)為是“酸”性中藥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[34]。

刺梨葉中的主要活性化學(xué)成分為黃酮、多酚、有機(jī)酸和三萜等類化合物。黃酮類化合物藥理作用主要與降血糖、調(diào)血脂、抗炎、抗過敏、抗腫瘤有關(guān)[35]。兒茶素及其類似的具有黃酮母核的化合物顯示出抗氧化、保護(hù)心血管、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥理作用，在抗氧化損傷方面也體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢[36-39]。多酚類物質(zhì)同樣具有抗氧化損傷、預(yù)防2 型糖尿病、調(diào)節(jié)脂代謝等藥理作用[40-41]。研究表明，植物提取物鞣花酸可直接清除活性氧自由基，抑制氧化應(yīng)激、強(qiáng)抗氧化酶活性及基因表達(dá)，減少DNA 損傷[42]。植物甾醇如β-谷甾醇可通過促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成達(dá)到預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。此外，β-谷甾醇還具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)體內(nèi)激素和調(diào)節(jié)代謝的作用[43-44]。三萜類化合物是一類具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗菌、保護(hù)肝腎、降血糖和抗腫瘤等藥理作用[45]。本研究從刺梨葉中解析出的三萜類成分刺梨苷通過抗氧化作用能夠明顯改善大鼠腦部組織的損傷，降低血清丙二醛水平，提升血清超氧化物歧化酶含量，從而改善急性高原缺氧癥狀，其抗氧化損傷方面的藥理作用或可對臨床應(yīng)用產(chǎn)生新的價值[46]。由以上幾種存在于刺梨葉中的主要活性成分的藥理作用可以看出，刺梨葉的藥理作用可能不僅局限于簡單的消食功效，其在抗氧化和調(diào)節(jié)代謝方面也能發(fā)揮一定療效，有待深入研究。