趙永恒 ,張 勇 ,秦志旺 ,董 陽(yáng) ,湯哲偉 ,陳富超 ,羅 雪,郝新才?

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心,十堰 442000;2.十堰市惠文藥業(yè)有限公司,十堰 442000;3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬東風(fēng)醫(yī)院 藥學(xué)部,十堰 442008)

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥葉[1],含有揮發(fā)油類[2]、黃酮類[3-4]、酚酸類[5-6]、多糖類[7]及礦物元素[8]等多種天然化學(xué)成分。艾葉揮發(fā)油是艾葉的主要功效成分,具有抗炎[9-10]、抗 病 原 微 生 物[11-12]、抗 氧 化[13-14]、抗 腫瘤[15-16]等作用,是衡量艾葉質(zhì)量的重要指標(biāo)。揮發(fā)油的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[17]、氣相色譜法[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19]等。GC-MS可在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品組分的定性、定量分析,多用于艾葉揮發(fā)油的鑒別[20],但采用該方法進(jìn)行產(chǎn)地差異分析的研究較少。鑒于此,本工作以湖北、安徽、山東、河南等地區(qū)的艾葉樣品為研究對(duì)象,采用GC-MS指紋圖譜和主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)及系統(tǒng)聚類分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,對(duì)不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行分類,以期為艾葉揮發(fā)油的資源開發(fā)及利用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ 8050型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配NIST14 系列標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù);SQP 型電子天平;ZNHW 型調(diào)溫電熱套。

正己烷為色譜純;氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

試驗(yàn)所用10 批艾葉購(gòu)自湖北、湖南、河南、山東、安徽等主產(chǎn)地,具體來(lái)源信息見表1。經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室鄧雪華副教授鑒定為菊科植物艾Artemisia ArgyiLevl.et Vant.的干燥葉。

表1 艾葉樣品來(lái)源信息Tab.1 Source information of Folium Artemisiae argyi samples

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Sh-Rtx-5Sil MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣;進(jìn)樣口溫度220 ℃;進(jìn)樣量1μL;流量3 mL·min－1;分流進(jìn)樣,分流比30∶1。柱升溫程序:初始溫度為50 ℃;以4 ℃·min－1速率升溫至110 ℃;再以10 ℃·min－1速率升溫至230 ℃,保持7 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150℃;溶劑延遲時(shí)間3 min;質(zhì)譜掃描范圍 質(zhì)荷比(m/z)40～550。

1.3 試驗(yàn)方法

參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)附錄XD 揮發(fā)油測(cè)定法中的甲法進(jìn)行提取。將來(lái)自不同產(chǎn)地的樣品粉碎、過(guò)三號(hào)篩(355μm±13μm)。稱取40 g 樣品,置于1 000 mL 圓底燒瓶中,加入700 mL水,連接揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管。飽和氯化鈉溶液100 mL 由冷凝器上端加載至燒瓶中,于100 ℃加熱回流5 h,直至提取器中上層揮發(fā)油量不再發(fā)生變化。關(guān)閉電源,放置10 h,分取0.1 mL,用正己烷稀釋至10 mL,搖勻后加入1.0 g無(wú)水硫酸鈉,過(guò)0.22μm 濾膜,濾液供GC-MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 艾葉揮發(fā)油的得率

按照試驗(yàn)方法分析10批艾葉,揮發(fā)油的得率見表2。

表2 10批艾葉揮發(fā)油的得率Tab.2 Yield of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

2.2 艾葉揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜及相似度分析

10批艾葉揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜見圖1。

圖1 艾葉揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint chromatograms of volatile oil in Folium Artemisiae argyi

經(jīng)NIST 譜庫(kù)檢索,在10批艾葉揮發(fā)油中共檢出103種成分,其中共有成分有21種。采用峰面積歸一化法確定揮發(fā)油各共有成分的相對(duì)含量,將實(shí)際得到的成分信息與譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì),得到其相似度值,結(jié)果見表3。

表3 共有成分信息Tab.3 Information of the common components

將10批艾葉揮發(fā)油的總離子流色譜圖導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),以S8的GC-MS指紋圖譜為參照?qǐng)D譜,以信號(hào)強(qiáng)度較大的桉油精色譜峰為參照峰進(jìn)行多點(diǎn)校正,計(jì)算各圖譜的整體相似度,結(jié)果見表4。

表4 10批艾葉揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的相似度結(jié)果Tab.4 Results of similarity of GC-MS fingerprint chromatograms of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

由表4可知,除S5(湖北省隨州市)、S6(安徽省亳州市)樣品的相似度(0.716,0.693)較低外,其他產(chǎn)地樣品的相似度均不小于0.916,整體相似度較高,故可以將S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10樣品聚為一類,S5、S6樣品分別聚為一類。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 主成分分析與偏最小二乘法-判別分析

運(yùn)用SIMCA-P 14.1 軟件中的PCA 和PLSDA 對(duì)10批艾葉揮發(fā)油的GC-MS共有峰信息進(jìn)行分析,相應(yīng)的得分圖見圖2。

圖2 10批艾葉揮發(fā)油共有峰的PCA 和PLS-DA 得分圖Fig.2 Score charts of PCA and PLS-DA of the common peaks of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

結(jié)果顯示:S5、S6樣品較離散,分別聚為一類,剩下8批樣品聚類一類,這與前述相似度分析結(jié)果一致,且PLS-DA 的聚類效果優(yōu)于PCA。選取5個(gè)主成分,PLS-DA 的累計(jì)模型解釋度為99.2%,累計(jì)模型預(yù)測(cè)能力為65.7%,說(shuō)明PLS-DA 的分類結(jié)果具有可靠性。

對(duì)21個(gè)共有峰進(jìn)行變量重要性投影(VIP)分析,結(jié)果見圖3。

圖3 21個(gè)共有峰的VIP值Fig.3 VIP values of the 21 common peaks

由圖3可知,1α,4β-二甲基-7β-異丙烯基-十氫萘酚(18)、α-松油醇(9)、4-萜烯醇(8)、龍腦(7)、蒿酮(4)、桉油精(3)、10,10-二甲基-2,6 亞甲基二環(huán)[7.2.0]十一烷-5-醇(16)、植酮(20)、樟腦(6)和植物醇(21)等10 個(gè)共有峰的VIP 值大于1,說(shuō)明這10種成分對(duì)不同產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油的質(zhì)量差異影響較大。

運(yùn)用置換檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型的有效性,累積解釋率(R2)回歸線用于評(píng)價(jià)模型是否可靠,R2回歸線在y軸的截距一般大于0.5;累積預(yù)測(cè)率(Q2)回歸線用于評(píng)價(jià)模型的擬合程度,Q2回歸線在y軸的截距為負(fù)值時(shí),表明模型沒有過(guò)擬合現(xiàn)象[21]。對(duì)21個(gè)共有峰的PLS-DA 模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn),結(jié)果顯示,R2回歸線截距為0.657,Q2回歸線截距為－0.154,PLS-DA 模型可靠,且擬合有效,說(shuō)明10批艾葉揮發(fā)油質(zhì)量是有差異的。

2.3.2 系統(tǒng)聚類分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件中的組間均聯(lián)法,采用平方歐式距離對(duì)10批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖4。

圖4 10批樣品的系統(tǒng)聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of hierarchial-cluster analysis of the 10 batches of samples

由圖4可知,當(dāng)平方歐式距離為15時(shí),10批樣品可聚為3 類,其中S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10樣品聚為一類,S5、S6樣品分別聚為一類,和PLSDA 以及相似度分析所得聚類結(jié)果一致,說(shuō)明3種分類方法均能反映不同產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油成分的差異,而產(chǎn)生差異的原因可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境(如土壤、氣候)及加工貯藏方式等有關(guān)。

本工作采用《中華人民共和國(guó)藥典》(2020 年版)中的揮發(fā)油提取方法提取了10批不同產(chǎn)地艾葉中的揮發(fā)油,利用GC-MS建立艾葉揮發(fā)油的指紋圖譜,共鑒定出103個(gè)成分,其中共有成分有21個(gè);分別采用相似度分析、PCA、PLS-DA 和系統(tǒng)聚類分析對(duì)樣品進(jìn)行分類,發(fā)現(xiàn)可將收集的艾葉分為3類,研究結(jié)果有望為艾葉揮發(fā)油的醫(yī)療研究等提供技術(shù)參考。