雷蓉，周亞楠，白潔，蘇建，劉永利

河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院 河北省中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050227

藥品質(zhì)量的一致性是臨床有效性和安全性的重要保證。中成藥組方藥味多，成分復(fù)雜，如何進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)一直是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵問題，原輔料質(zhì)量、藥品生產(chǎn)工藝參數(shù)和人員變動(dòng)等因素都會(huì)影響到批間的一致性[1-2]。色譜指紋圖譜能較為全面地展現(xiàn)組方中各藥味的化學(xué)組成，在中藥質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)中作為一種較為成熟的技術(shù)得到廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)模式識(shí)別技術(shù)主要包括主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLSDA）等，通過降維對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)綜合分析，達(dá)到分類、識(shí)別并篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物的目的。目前，色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別已成為一種重要的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方式[3-21]。

四季三黃片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第二十冊(cè)，由大黃、黃芩、黃柏、梔子4 味中藥制成，具有消炎退熱、通便利水的功效，臨床上主要用于治療口鼻生瘡、咽喉腫痛、大便秘結(jié)、小便赤黃等癥[22]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了四季三黃片的指紋圖譜，指認(rèn)了21 個(gè)共有峰，在指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)分析評(píng)價(jià)了23 批來源于4 個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品質(zhì)量與批間一致性，為四季三黃片整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超高壓液相-離子阱靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC LTQ Orbitrap MS，配備Dionex UltiMate 3000 型UPLC 儀、LTQ-Orbitrap Elite 組合型高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo 公司）；XPE26 型電子天平（0.001 mg）、XS105DU 型電子天平（0.01 mg）均購于瑞士Mettler-Toledo 公司；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品梔子苷（批號(hào)：110749-201919，純度：97.1%）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201212，純度：86.8%）、黃芩素（批號(hào)：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素（批號(hào)：111514-201706，純度：100.0%）、蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710，純度：99.5%）、大黃酸（批號(hào)：110757-201607，純度：99.3%）、大黃素（批號(hào)：110756-201512， 度：98.7%）、漢黃芩苷（批號(hào)：112002-201702，純度：98.5%）、大黃酚（批號(hào)：110796-201922，純度：99.4%）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817，純度：99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；三氟乙酸（色譜純，天津化學(xué)有限公司）；水為超純水。23批四季三黃片抽自全國各地經(jīng)營、使用單位，涉及4 家生產(chǎn)企業(yè)，其中A 企業(yè)樣品4 批次（S1～S4）、B企業(yè)樣品2批（S5～S6）、C企業(yè)樣品6批（S7～S12）、D企業(yè)樣品11批（S13～S23）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu Shim-pack gist C18（100 mm×2.1mm，2 μm），以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，10%～15%A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～42%A；30～45 min，42%～75%A）；體積流量為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；檢測波長為254nm。UPLC LTQ Orbitrap MS分析過程以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，其余條件同上。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）噴霧電壓:+3.5 kV；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：10 arb；毛細(xì)管溫度：300 ℃；加熱器溫度：300 ℃；掃描方式：傅里葉變換高分辨全掃模式，數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS2，掃描范圍：m/z150～2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 取鹽酸小檗堿、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.08055、0.20330、0.05013、0.08887、0.03105、0.014 20、0.019 97、0.009 18、0.017 90、0.016 94、0.025 91 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取四季三黃片粉末0.4 g，精密稱定，放置到錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（700 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（S9），按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6 次，測定并分析數(shù)據(jù)，以4 號(hào)峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.19%，相對(duì)峰面積的RSD為0.17%～1.66%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的樣品（S9），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件測定并分析，以4 號(hào)峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.01%～0.11%，相對(duì)峰 面積的RSD 為0.41%～1.96%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)S9 供試品溶液，分別在0、1、3、6、12、16、24 h 進(jìn)樣測定并分析，以4 號(hào)峰（黃芩苷）為參照峰，各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.03%～0.23%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.30%～2.18%，表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 指紋圖譜的建立和共有峰的指認(rèn) 取23批四季三黃片的供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）對(duì)23批樣品的色譜圖進(jìn)行分析，將S1樣品的色譜圖設(shè)為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，多點(diǎn)校正后自動(dòng)峰匹配，標(biāo)定了21 個(gè)共有峰，所有樣品的疊加圖見圖1，典型樣品和對(duì)照品色譜圖見圖2，其中11個(gè)峰采用對(duì)照品比對(duì)進(jìn)行了確證，其余的10個(gè)共有峰采用LTQ Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行指認(rèn)，離子碎片信息見表1。共有峰中1 號(hào)峰來自于梔子，2、9、18 號(hào)峰來自黃柏，3～7、10～14 號(hào)峰均來自黃芩，15、16、19～21號(hào)峰來自大黃。

表1 四季三黃片正離子模式下的化合物鑒定及歸屬

圖1 23批四季三黃片的UPLC疊加圖

圖2 四季三黃片混合對(duì)照品和樣品的UPLC圖

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 對(duì)23批四季三黃片的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表2。A 企業(yè)的樣品相似度均在0.979以上，B企業(yè)樣品相似度為0.869～0.944，C 企業(yè)樣品相似度為0.442～0.973，D 企業(yè)樣品相似度為0.730～0.933，表明4 家生產(chǎn)企業(yè)樣品質(zhì)量差異較大，A、B、D 3家企業(yè)內(nèi)不同批次樣品質(zhì)量一致性較好，而C企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量一致性較差。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 HCA HCA 可以更直觀地展現(xiàn)樣品批間化學(xué)組分的差異性，利用OriginPro 2021軟件對(duì)21個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)HCA，結(jié)果見圖3。23批樣品按各生產(chǎn)企業(yè)聚為3類，A、D 企業(yè)各為一類，B、C企業(yè)聚為一類，

圖3 23批四季三黃片的HCA

2.5.2 PCA 采用SIMCA 12.0 軟件23 批樣品的21 個(gè)共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，以主成分特征值及累積方差貢獻(xiàn)率進(jìn)行篩選，通過繪制的得分圖與載荷圖對(duì)模型進(jìn)行解釋，進(jìn)一步應(yīng)用Hotelling'sT2和DModX控制圖對(duì)樣品批間質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。

模型擬合后共提取5 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為93.7%，見表3。其中PC1和PC2累積方差貢獻(xiàn)率為70.4%，可以代表21 個(gè)共有峰的主要信息，繪制得分圖（圖4）、載荷圖（圖5）。由圖4 可知，23批樣品按不同企業(yè)分類明顯，與HCA 結(jié)果一致，表明不同企業(yè)間樣品一致性較差。載荷圖距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量，權(quán)重越大，代表該化合物的含量對(duì)樣品的整體分布所起的作用越大。由圖5可知，C21（大黃素甲醚）、C2對(duì)PC1貢獻(xiàn)較大，C4、C6（黃芩苷）對(duì)PC2貢獻(xiàn)較大。

圖4 23批四季三黃片樣品的PCA散點(diǎn)得分

圖5 23批四季三黃片樣品的主成分載荷圖

表2 23批樣品的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)分析結(jié)果

表3 四季三黃片PCA特征值與累積方差貢獻(xiàn)率 %

2.5.3 Hotelling'sT2和DModX 控制限的建立 Hotelling'sT2和DModX控制圖用來監(jiān)測不同批次的產(chǎn)品的一致性，是2 個(gè)互補(bǔ)的多變量分析手段，可用于分析超出控制限批次產(chǎn)品的異常波動(dòng)受哪些變量的影響[20]。Hotelling'sT2和DModX 的控制圖見圖6～7，圖中T2Crit（99%）和D Crit 為控制限，其上限分別為25.95、1.59；圖中的T2Crit（95%）為警戒限，上限為17.06。23 批樣品的波動(dòng)范圍在均在控制限之下，為正常批次產(chǎn)品。

圖6 23批四季三黃片樣品的Hotelling's T2控制圖

2.5.4 PLS-DA 經(jīng)過上述分析，雖然各批次產(chǎn)質(zhì)量均在可控范圍內(nèi)，未出現(xiàn)異常批次，但各企業(yè)間樣品分類明顯，為進(jìn)一步篩選出導(dǎo)致23 批樣品產(chǎn)生差異的成分，采用OPLS-DA，利用變量重要性投影（VIP）值進(jìn)行預(yù)測分析（圖8）。以VIP 值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出C18、C5、C10、C2、C19、C4、C6、C9、C7、C1、C21 11個(gè)化合物為引起樣品間差異的主要因素。其中影響較大的是C18、C5 和C10，其中C18 來源于黃柏，C5 和C10 來源于黃芩，提示生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注黃柏、黃芩投料的原藥質(zhì)量。

圖7 23批四季三黃片樣品的DModX控制圖

圖8 四季三黃片的OPLS-DA的VIP值（, n=23）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

在供試品溶液制備方法考察時(shí)，分別考察了不同提取方式（超聲、回流）、不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、不同提取時(shí)間（15、30、45 min）、不同提取溶劑體積（25、50、100 mL）對(duì)四季三黃片中有效成分提取的影響，綜合色譜峰數(shù)量及響應(yīng)值，確定采用70%甲醇超聲提取30 min 的方法。

在考察液相色譜條件時(shí)，分別考察了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%醋酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，結(jié)果表明，乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脫呈現(xiàn)的色譜峰分離度良好，峰形最佳。并通過全波長掃描，樣品在254 nm 下色譜峰較多，且峰面積較大，故選擇了254 nm 作為檢測波長。

3.2 不同企業(yè)間樣品質(zhì)量一致性分析

由相似度、PCA、HCA 結(jié)果可知，不同企業(yè)間樣品質(zhì)量差異明顯，尤其C 企業(yè)與其他3 家差距大，通過進(jìn)一步對(duì)篩選出來的3 個(gè)影響較大的差異標(biāo)志性化合物C18、C5 和C10 原始數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)C 企業(yè)樣品中這3個(gè)化合物的相對(duì)含量均遠(yuǎn)低于其他3個(gè)企業(yè)，表明C 企業(yè)所投黃柏、黃芩質(zhì)量與其他3 家有較大差異，提示企業(yè)應(yīng)關(guān)注這2種中藥的質(zhì)量。

3.3 同一企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量一致性分析

由以上結(jié)果可知，A、B、D 3家企業(yè)內(nèi)樣品質(zhì)量一致性較好，而C企業(yè)內(nèi)樣品批次間一致性較差，將其指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，模型擬合后共提取2個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為82.1%，將6 批樣品明顯沿PC1分成了兩類，其中S8、S12為一類，其余4批為一類，對(duì)分布貢獻(xiàn)較大的化合物為C4、C1、C2，其中C4 來源于黃柏，C1 來源于梔子，C2 來源于黃芩，S8、S12中3個(gè)化合物的相對(duì)含量均明顯低于其他批次，提示C 企業(yè)黃柏和黃芩原料的質(zhì)量不穩(wěn)定，建議重點(diǎn)關(guān)注。

建立以質(zhì)量一致性為核心的中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系有利于促進(jìn)中成藥質(zhì)量的全面提升。本研究所建立的四季三黃片UPLC 指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別分析的方法可對(duì)四季三黃片的質(zhì)量一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)，可為全面提升該產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。