朱 藝，肖 斌，劉嘉慧，黃 玲，孫朝暉，李林海

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510000；3.玉溪市中心血站，云南 玉溪 653100；

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的主要原因。2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的癌癥［1］。乳腺癌可根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達(dá)情況及Ki-67增殖指數(shù)進(jìn)行分子分型，其中HER2陽性型乳腺癌惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，是乳腺癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)［2-3］。HER2能夠影響PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且HER2陽性乳腺癌中波形蛋白（vimentin）、轉(zhuǎn)錄因子Slug、轉(zhuǎn)錄因子Twist表達(dá)明顯高于癌旁組織，鈣黏蛋白E（E-cadherin）的表達(dá)明顯低于癌旁組織，提示HER2陽性乳腺癌細(xì)胞更容易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)進(jìn)程［4］，該型乳腺癌細(xì)胞更常出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和浸潤等。為了改善HER2陽性乳腺癌的治療現(xiàn)狀，有必要研究和探討HER2陽性型乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，普遍存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，與基因表達(dá)調(diào)控［5］、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等細(xì)胞進(jìn)程密切相關(guān)［6］。CircRNA的表達(dá)失調(diào)在胃癌［7］、肝癌［8］、肺癌［9］等多種腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展也與circRNA的表達(dá)異常相關(guān)，許多研究［10-11］證實(shí)circRNA能夠通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Circ-CCDC9可吸附miR-6792-3p，與微囊蛋白1（caveolin-1，CAV1）形成分子海綿調(diào)節(jié)網(wǎng)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制胃癌的進(jìn)展，因此circ-CCDC9是胃癌的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［12］。Circ-TADA2A-E6是三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的抑癌基因，在TNBC中呈顯著低表達(dá)，能夠正向調(diào)節(jié)靶基因細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白-3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）的表達(dá)，從而削弱乳腺癌的侵襲性［13］，但circRNA在HER2陽性型乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制仍不清楚。

本研究以高通量circRNA芯片為切入點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注circ-0003910在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，探究circ-0003910的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系，通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定circ-0003910調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，為HER2陽性型乳腺癌的診斷與治療提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）和人乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、MCF-7、BT-474，SK-BR-3，UACC-812）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，MCF-10A專用培養(yǎng)基購自武漢普賽諾生命科技有限公司，1%青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司，Lipofectamine?3000購自美國ThermoFisher公司，SYBR Green染料試劑盒和PrimeScript RT試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。過表達(dá)circ-0003910 pSin-puro質(zhì)粒由江西南昌聚焦生物科技有限公司構(gòu)建。Circ-0003910的siRNA、RNA熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）試劑盒與探針購自廣州銳博生物科技有限公司，BaseScope二代紅色試劑盒（323900）購自美國ACD公司，139例乳腺癌組織芯片（HBreD139Su01）及90例正常乳腺組織芯片（HBre-Duc090Sur-01）購自上海芯超生物科技有限公司。

1.2 CircRNA芯片實(shí)驗(yàn)

提取4種乳腺癌細(xì)胞系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光標(biāo)記，并進(jìn)行標(biāo)記效率質(zhì)檢，質(zhì)控合格后進(jìn)行芯片雜交。采用Agilent Scanner G2505C掃描儀掃描芯片，使用Agilent Feature Extraction（11.0.1.1版本）采集圖像，并讀取數(shù)值。經(jīng)歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理后，使用散點(diǎn)圖和差異倍數(shù)篩選出兩組間差異表達(dá)倍數(shù)大于2（fold change＞2）circRNA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、UACC-812用DMEM培養(yǎng)，BT-474用RPMI-1640培養(yǎng)，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A用MCF-10A專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，均在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液。細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～ 90%時(shí)傳代。

1.4 FISH實(shí)驗(yàn)

SK-BR-3細(xì)胞爬片后用4%多聚甲醛固定20 min，預(yù)冷的0.5%Triton X-100通透細(xì)胞，37 ℃探針預(yù)雜交以及探針雜交。采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核DNA染色20 min后挑片，根據(jù)玻片大小用適量抗熒光淬滅劑封片，避光置于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.5 BaseScope實(shí)驗(yàn)

139例乳腺癌患者的手術(shù)時(shí)間從2001年1月—2004年8月，隨訪周期9.0～ 12.5年，最長隨訪時(shí)間至2013年7月，芯片附帶有每個(gè)樣本的ER、PR、HER2與Ki-67的免疫組織化學(xué)檢測數(shù)據(jù)。首先將組織芯片進(jìn)行烤片60 min，隨后二甲苯與無水乙醇脫蠟20 min；經(jīng)雙氧水處理10 min后，用現(xiàn)配的靶標(biāo)修復(fù)試劑在98～ 102 ℃緩慢沸騰進(jìn)行靶標(biāo)修復(fù)15～ 30 min，再用蛋白酶處理15～ 30 min；芯片用APM1-8試劑覆蓋溫育，進(jìn)行信號(hào)放大，再用50%蘇木精染液染色2 min；蒸餾水清洗后用現(xiàn)配的0.02%氨水復(fù)染玻片；再次用蒸餾水清洗并烘干，根據(jù)組織芯片大小用適量VectaMont封片液進(jìn)行封片，最后掃描全片。在實(shí)驗(yàn)過程中，因部分組織脫落，實(shí)際可檢測乳腺癌組織131例和乳腺正常組織82例，乳腺癌組織根據(jù)芯片已有的免疫組織化學(xué)結(jié)果分型，其中三陰性組織32例，luminal A型組織47例，luminal B型組織26例，HER2陽性型組織26例。運(yùn)用QuPath軟件分析各組織信號(hào)強(qiáng)度，用GraphPad Prism 8對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在生存分析中，以信號(hào)值≥2作為circ-0003910高表達(dá)組（25例），信號(hào)值＜2作為circ-0003910低表達(dá)組（106例）。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

消化細(xì)胞并離心后，棄上清液；細(xì)胞用1 mL無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)。在transwell小室的下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸20萬細(xì)胞并加入transwell小室的上室，保證細(xì)胞分布均勻；將transwell小室置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中溫育24 h。次日，甩干凈小室內(nèi)培養(yǎng)基后用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，待干燥后用中性樹膠和蓋玻片封片。顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍攝，采用Image J軟件分析遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

用TRIzol試劑盒（購自加拿大Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA，分光光度儀測總RNA 濃度。用Prime ScriptRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，在BIORAD熒光定量PCR儀上利用SYBR Green染料試劑盒檢測待測基因的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；GOTO：39（40 個(gè)循環(huán)），95 ℃，5 s；熔解曲線。circ-0003910上游引物5'-GCTATAAGCTTCTTGAAGGCAG AG-3'，下游引物5'-TTGCTTGGTTTTGCAGTAGATAC TT-3'。GAPDH上游引物5'-GAACGGGAAGC TCACTGG-3'，下游引物5'-GCCTGCTTCACC ACCTTCT。

1.8 TMT蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，加入4 ℃預(yù)冷PBS，平放輕輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞1 min，棄PBS，重復(fù)洗滌2次。在冰上加入預(yù)冷的PBS，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿一側(cè)，吸取液體至預(yù)冷的離心管內(nèi)，離心去上清液后液氮速凍。由上海中科新生命公司完成質(zhì)譜分析。

1.9 GO分析和KEGG分析

用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線網(wǎng)站對(duì)這些蛋白進(jìn)行功能分類注釋，并進(jìn)行功能富集分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。對(duì)于兩組定量資料分析比較，若滿足正態(tài)分布，且滿足方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以表示；只滿足正態(tài)分布，不滿足方差齊性，采用Welch’s校正非配對(duì)t檢驗(yàn)，以表示；不滿足正態(tài)分布，則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)

為了篩選在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的circRNA，本研究整合了SK-BR-3細(xì)胞（HER2陽性型）、MDA-MB-231細(xì)胞（三陰性型）、MCF-7細(xì)胞（luminal型）和MCF-10A細(xì)胞（正常乳腺上皮細(xì)胞）的標(biāo)準(zhǔn)化circRNA芯片表達(dá)數(shù)據(jù)（圖1），根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫注釋所得circRNA的名稱，計(jì)算差異倍數(shù)，納入差異倍數(shù)絕對(duì)值大于2的circRNA（fold change＞2，P＜0.05）。在HER2陽性型乳腺癌細(xì)胞組（SK-BR-3）與正常乳腺上皮細(xì)胞組（MCF-10A）比較中獲得上調(diào)的circRNA 845個(gè)，下調(diào)的circRNA 998個(gè)；在三陰性乳腺癌細(xì)胞組（MDA-MB-231）vs正常乳腺上皮細(xì)胞組（MCF-10A）中獲得上調(diào)的circRNA共938個(gè)，下調(diào)的circRNA共1154個(gè)；在luminal型乳腺癌細(xì)胞組（MCF-7）vs正常乳腺上皮細(xì)胞組（MCF-10A）中獲得上調(diào)的circRNA 973個(gè)，下調(diào)的circRNA共793個(gè)（圖2）。排除在三陰性乳腺癌細(xì)胞組和luminal型乳腺癌細(xì)胞組中同樣上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)circRNA，獲得僅在HER2陽性型乳腺癌細(xì)胞組中差異表達(dá)倍數(shù)大于2（fold change＞2，P＜0.05）的circRNA，共889個(gè)，其中上調(diào)515個(gè)，下調(diào)374個(gè)。其中circ-0003910的差異表達(dá)倍數(shù)為24.39，引起我們的關(guān)注。我們通過RTFQ-PCR檢測了circ-0003910在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和5種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（三陰性型）、MCF-7（luminal A型）、BT-474（luminal B型）、SK-BR-3（HER2陽性型）、UACC-812（HER2陽性型）中的表達(dá)量，結(jié)果表明circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞（UACC-812、SK-BR-3）中表達(dá)顯著上調(diào)（圖2H）。為了明確circ-0003910的亞細(xì)胞定位，我們在SKBR-3細(xì)胞中進(jìn)行了FISH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，circ-0003910定位于HER2陽性型乳腺癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2I）。

圖1 circRNA芯片熒光掃描圖Fig.1 Fluorescence scan of circRNA microarraies

圖2 Circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)Fig.2 Circ-0003910 was up-regulated in HER2 positive breast cancer cells

2.2 Circ-0003910在乳腺癌組織中的表達(dá)與患者預(yù) 后

為了明確circ-0003910在乳腺癌組織中的表達(dá)水平和定位，本研究通過BaseScope實(shí)驗(yàn)檢測circ-0003910在131例乳腺癌組織和82例正常乳腺組織中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circ-0003910分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)，與FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖3A）。與正常組織相比，高表達(dá)circ-0003910的樣本更多分布于乳腺癌組織，但兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。在不同分子分型的乳腺癌組織樣本中，高表達(dá)circ-0003910主要分布于HER2陽性乳腺癌組織，其表達(dá)量與luminal A型乳腺癌組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與其他分子分型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。Kaplan-Meier生存分析表明，高表達(dá)circ-0003910提示乳腺癌患者的預(yù)后可能更差，生存曲線無交叉（P=0.0559，圖3D）。

圖3 Circ-0003910在乳腺癌組織中的表達(dá)與預(yù)后Fig.3 Expression and prognosis of circ-0003910 in breast cancer tissues

2.3 Circ-0003910在體外促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

為了探討circ-0003910在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究在circ-0003910相對(duì)表達(dá)量較低的MDA-MB-231細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染circ-0003910過表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒，另在circ-0003910相對(duì)表達(dá)量較高的SK-BR-3細(xì)胞中用siRNA敲低circ-0003910，用RTFQ-PCR驗(yàn)證circ-0003910的過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型構(gòu)建成功。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因之一［14］，推測過表達(dá)（敲低）circ-0003910可能影響乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circ-0003910能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲，沉默circ-0003910則抑制SK-BR-3細(xì)胞遷移和侵襲（圖4）。

圖4 Circ-0003910在體外促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲Fig.4 Circ-0003910 promotes breast cancer cell migration and invasion in vitro

2.4 高表達(dá)circ-0003910影響的蛋白質(zhì)組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及差異蛋白的功能富集分析

為了確定circ-0003910可能通過哪些蛋白影響乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究采用circ-0003910內(nèi)源性相對(duì)表達(dá)量較低的MCF-7細(xì)胞構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)circ-0003910的細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞，并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，篩選顯著性差異表達(dá)蛋白質(zhì)。以差異表達(dá)倍數(shù)FC＞1.2倍（上調(diào)大于1.2倍或下調(diào)小于0.83倍）且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出104個(gè)蛋白質(zhì)在過表達(dá)circ-0003910細(xì)胞中上調(diào)，93個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。對(duì)197個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。GO分析中的生物學(xué)過程（biological process，BP）顯示，差異表達(dá)蛋白參與了細(xì)胞增殖、染色質(zhì)的組裝和調(diào)控、核小體的組裝、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體的裝配及炎癥刺激相關(guān)反應(yīng)等；細(xì)胞學(xué)組分（cellular component，CC）顯示，差異表達(dá)蛋白主要位于染色體中的蛋白、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體、宿主細(xì)胞組分等；分子生物學(xué)功能（molecular function，MF）分析顯示，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與染色質(zhì)及核小體DNA的結(jié)合、雙鏈DNA形成及彎曲、蛋白質(zhì)二聚化等進(jìn)程（圖5）。

圖5 Circ-0003910影響下游差異表達(dá)蛋白GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of downstream differentially expressed proteins affected by circ-0003910 overexpression

KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析表明，差異表達(dá)蛋白主要富集于與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的細(xì)胞黏附分子合成（包括整聯(lián)蛋白家族的ITGB1、ICAM1和L1CAM）和參與癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)的組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子（包括H3C15、H3C1和DDIT3）等（圖6）。

圖6 Circ-0003910影響下游差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of downstream differentially expressed proteins affected by circ-0003910

3 討 論

乳腺癌是一種威脅全球女性健康的腫瘤，發(fā)病率逐年上升，中國是全球乳腺癌發(fā)病例數(shù)最多的國家，并且乳腺癌患者呈現(xiàn)低齡化趨勢［15］。HER2陽性型乳腺癌占所有乳腺癌病例數(shù)的15%～ 20%，其復(fù)發(fā)率高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移概率高、內(nèi)分泌治療反應(yīng)性低并且預(yù)后較差。尋找新的生物標(biāo)志物用于早期診斷和及時(shí)治療，是提高乳腺癌患者生存率與生存質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前，circRNA相關(guān)研究主要報(bào)道了其可以作為miRNA海綿，與RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用，參與蛋白質(zhì)翻譯或直接調(diào)控靶基因等作用［16］。CircRNA具有共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、能夠避免RNase R的降解、比線性RNA更加穩(wěn)定、有明顯的物種間保守性和組織特異性等特征［17-18］，具有成為理想的腫瘤早期診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物的潛力。本研究通過circRNA芯片技術(shù)篩選出在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系中差異表達(dá)circRNA，其中circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)，提示其可能參與下游蛋白的表達(dá)調(diào)控。Basescope實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其在HER2陽性乳腺癌組織中明顯高表達(dá)。更重要的是，circ-0003910表達(dá)量與預(yù)后雖無顯著相關(guān)性，但P值為0.0559，已接近臨界值0.05，提示高表達(dá)circ-0003910的乳腺癌患者預(yù)后可能更差。此外，本研究通過構(gòu)建circ-0003910過表達(dá)和敲低的乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circ-0003910能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明，circ-0003910是乳腺癌轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因，可能是乳腺癌患者的預(yù)后預(yù)測因子。

BaseScope的實(shí)驗(yàn)流程分為切片準(zhǔn)備、RNA雜交、信號(hào)放大和成像4個(gè)環(huán)節(jié)。BaseScope基于信號(hào)放大和背景抑制技術(shù)［19］，將組織樣本中的單個(gè)RNA可視化呈現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)技術(shù)擁有高靈敏度、高特異性和高信噪比的優(yōu)點(diǎn)，并且與PCR、免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果都有很好的一致性。在本研究中，陽性信號(hào)探針和陰性對(duì)照組的染色結(jié)果均符合預(yù)期，表明實(shí)驗(yàn)過程無問題。實(shí)驗(yàn)組染色結(jié)果顯示，circ-0003910僅在部分乳腺癌組織中高表達(dá)，而在正常乳腺組織中circ-0003910幾乎不表達(dá)，推測circ-0003910的表達(dá)水平可能在特定乳腺癌樣本類型中受到特定順式作用元件的調(diào)控。

circRNA可通過作為分子海綿、蛋白質(zhì)支架和誘餌等方式影響下游靶蛋白的表達(dá)［20］。本研究繪制了高表達(dá)circ-0003910后的乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。GO分析結(jié)果表明，受circ-0003910調(diào)控的蛋白質(zhì)主要參與染色質(zhì)、DNA的構(gòu)象、組裝、結(jié)合、基因表達(dá)與沉默的負(fù)調(diào)控等進(jìn)程。在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞黏附相關(guān)的整聯(lián)蛋白家族成員，包括ITGB1、ICAM1和L1CAM均顯著高表達(dá)。β1整聯(lián)蛋白（integrin beta 1，ITGB1）為整聯(lián)蛋白家族成員，可以和α亞基結(jié)合形成12種整聯(lián)蛋白受體，與膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合［21］，在細(xì)胞黏附和遷移中起重要作用［22］。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）是乳腺癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，可通過激活與細(xì)胞周期和細(xì)胞干性相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。阻斷同源性ICAM1相互作用可以顯著抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的形成、內(nèi)皮遷移和肺轉(zhuǎn)移［23-24］。L1-細(xì)胞黏附分子（L1-cell adhesion molecule，L1CAM）在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和遷移能力，并且常與不良預(yù)后相關(guān)［25］。在乳腺癌中，L1CAM及其可溶性形式可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和遷移能力［26］。鑒于上述差異表達(dá)蛋白質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，circ-0003910可能通過調(diào)控這些蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)而影響HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在后續(xù)研究中，我們將圍繞circ-0003910如何影響整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移的分子機(jī)制進(jìn)行深入探索。

綜上，circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌組織中呈高表達(dá)，影響與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，發(fā)揮致癌基因效應(yīng)。circ-0003910可能是HER2陽性乳腺癌新的生物標(biāo)志物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。