周海燕，游婧璨，陳妮，鄧鑫，李永杰，王立群

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院心血管藥理系（瀘州 646000）

血管新生是指在原有血管結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)出新血管并形成血管網(wǎng)的生物學(xué)行為，其在胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的相互作用以及由此介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和鋪展是血管新生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[2-3]。而內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的分子機(jī)制仍未完全闡明。

整聯(lián)蛋白又稱整合素，是表達(dá)于細(xì)胞表面的ECM受體，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互識(shí)別和粘附。磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl ino?sitol 3-kinase，PI3K）-Akt 是ECM-整聯(lián)蛋白激活的重要信號(hào)通路之一，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能[4-5]。研究表明PI3K-Akt 信號(hào)通路在ECM-整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞[6]，成纖維細(xì)胞[7]以及癌細(xì)胞[8]鋪展中均起關(guān)鍵作用。然而，PI3K-Akt激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的影響仍不清楚。

纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）是ECM 的重要組成部分，也是維持血管結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵蛋白[9]。大量研究表明，F(xiàn)N及其受體在胚胎發(fā)生和血管發(fā)育中起著重要作用，F(xiàn)N基因缺失的小鼠伴有嚴(yán)重的血管發(fā)育障礙并在胚胎期死亡[10]?；贔N穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，保護(hù)血管的生理作用，其在細(xì)胞與ECM 的相互作用研究中被廣泛應(yīng)用。因此，本研究將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）接種于FN上，以研究Akt信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的影響，從而揭示內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的潛在分子機(jī)制，為臨床上治療血管新生障礙性疾病提供新的靶點(diǎn)與策略。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（批號(hào)：#8000）和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（批號(hào)：#1001）購(gòu)自ScienCell 公司（美國(guó)）；FN（批號(hào)：F2006）購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；磷酸化Akt抗體（批號(hào)：#4060）和總Akt抗體（批號(hào)：#4691）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司（美國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶-山羊抗兔IgG（批號(hào)：A0208）、PI3K-Akt通路抑制劑LY294002（批號(hào)：S1737）和渥曼青霉素（Wortmannin）（批號(hào)：#S1952）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RGDS和RGES由上海昕浩生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs 培養(yǎng)于含5%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素以及1%內(nèi)皮生長(zhǎng)因子添加劑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，第3～10代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞鋪展

將FN（10 μg/mL）或PBS 加入24 孔板中，4 ℃鋪板過(guò)夜，PBS 清洗3 三次，5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，PBS 再次清洗3 次后，接種HUVECs，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30、60、90、120、180和240 min；在有些實(shí)驗(yàn)中，分別利用LY294002（50 μM）和渥曼青霉素（1 μM）或RGDS（200 μM）和REGS（200 μM）預(yù)處理HU?VECs 30 min，再將HUVECs 接種到預(yù)先鋪有FN 的24孔板中培養(yǎng)120 min，細(xì)胞拍照，使用ImageJ 軟件計(jì)算細(xì)胞面積，以評(píng)價(jià)細(xì)胞鋪展。

1.4 免疫印跡

將FN（10 μg/mL）或PBS加入6孔板中，4 ℃鋪板過(guò)夜，PBS清洗3次，5%胎牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，PBS 再次清洗3 次后，接種HUVECs，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30、60、90、120、180和240 min；在有些實(shí)驗(yàn)中，分別利用LY294002（50 μM）和渥曼青霉素（1 μM）或RGDS（200 μM）和REGS（200 μM）預(yù)處理30 min后，再將HUVECs接種到FN包被的6孔板中培養(yǎng)1 h，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入抗-磷酸化Akt 抗體（1∶1 000）或抗-總Akt 抗體（1∶1 000），4°C 孵育過(guò)夜，用含0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌之后，加入辣根過(guò)氧化物酶-山羊抗兔IgG 室溫下孵育1 h，進(jìn)一步洗滌之后，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，曝光顯影，使用ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單向方差分析（One-Way ANOVA）對(duì)多組間進(jìn)行比較后，進(jìn)行Post Hoc 檢驗(yàn)，LSD 法比較兩組間差異，以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FN介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展

在本研究中，我們首先評(píng)價(jià)了FN對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)HUVECs 接種于PBS上時(shí)，細(xì)胞的鋪展面積在240 min內(nèi)幾乎無(wú)變化；而當(dāng)HUVECs接種于FN上時(shí)，細(xì)胞的鋪展面積以時(shí)間依賴的方式逐漸增加，在120 min 時(shí)達(dá)到峰值，并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著高于PBS組，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1），表明FN顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展。

圖1 FN對(duì)細(xì)胞鋪展的影響Figure 1 The effects of FN on cell spreading

2.2 FN 通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展

為了探究?jī)?nèi)皮細(xì)胞鋪展的潛在分子機(jī)制，我們檢測(cè)了FN 對(duì)Akt 磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)HU?VECs接種于PBS上，Akt的磷酸化水平在120 min內(nèi)基本無(wú)變化；而當(dāng)HUVECs 接種于FN 上15 min，Akt 的磷酸化水平與對(duì)照組相比增加了93.8%，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的升高，60 min時(shí)達(dá)到峰值，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著高于PBS組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2），表明FN介導(dǎo)Akt 激活。隨后，我們分別利用PI3K-Akt 信號(hào)通路抑制劑LY294002 和渥曼青霉素預(yù)處理HUVECs 30 min，再將其接種于FN 包被的24 孔板中，Western blot的結(jié)果顯示：LY294002 和渥曼青霉素都顯著抑制了Akt的磷酸化，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A，B）。而計(jì)算細(xì)胞鋪展面積，發(fā)現(xiàn)與FN組相比，LY294002和渥曼青霉素預(yù)處理組細(xì)胞鋪展面積都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05（圖3C，D），表明FN通過(guò)PI3KAkt信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展。

圖2 FN介導(dǎo)Akt激活Figure 2 FN induces Akt activation

圖3 FN通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞鋪展Figure 3 FN induces endothelial cell spreading through PI3K-Akt signaling pathway

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞鋪展需要整聯(lián)蛋白依賴的Akt激活

整聯(lián)蛋白是表達(dá)于細(xì)胞表面的ECM 受體，ECM-整聯(lián)蛋白的相互作用激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路。為了明確FN 介導(dǎo)的Akt 激活是否需要整聯(lián)蛋白，我們檢測(cè)了整聯(lián)蛋白抑制劑RGDS 短肽或?qū)φ斩屉腞GES對(duì)Akt 磷酸化水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RGDS 顯著抑制了FN介導(dǎo)的Akt磷酸化，RGDS組Akt磷酸化水平減少了66.1%，P <0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而對(duì)照短肽RGES對(duì)FN介導(dǎo)的Akt激活無(wú)顯著影響（圖4），表明FN介導(dǎo)的Akt 激活是整聯(lián)蛋白依賴的。為了進(jìn)一步探究整聯(lián)蛋白依賴的Akt激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的影響，我們檢測(cè)了整聯(lián)蛋白抑制劑RGDS 短肽或?qū)φ斩屉腞GES預(yù)處理后，細(xì)胞鋪展面積的變化，結(jié)果顯示：與FN組相比，RGDS預(yù)處理組，細(xì)胞鋪展面積顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05（圖5），表明整聯(lián)蛋白依賴的Akt激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展是必須的。

圖4 整聯(lián)蛋白抑制劑RGDS對(duì)FN介導(dǎo)Akt激活的影響Figure 4 The effects of RGDS（integrin inhibitor）on FN-induced Akt activation

圖5 FN通過(guò)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞鋪展Figure 5 FN induces endothelial cell spreading through integrins

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ECM 除了為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)性支持外，在調(diào)控細(xì)胞粘附、鋪展、遷移和存活等過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。FN 是細(xì)胞外基質(zhì)中最早發(fā)現(xiàn)的非膠原糖蛋白，其功能之一是作為基底膜的組成部分調(diào)控血管網(wǎng)絡(luò)的形成，因此對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生理和病理生理過(guò)程有重要影響[10]。本研究首先探討了FN 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展。之前的研究表明FN 可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[12]、NIH3T3 細(xì)胞[13]和纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞[14]等多種細(xì)胞的鋪展，這與我們的研究結(jié)果一致。并且有文獻(xiàn)報(bào)道：細(xì)胞在FN 上鋪展的早期步驟主要分為初步黏附期，細(xì)胞面積快速增長(zhǎng)期以及緩慢鋪展期三個(gè)階段[15]，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)HUVECs而言，0～30 min為細(xì)胞初步粘附期，30～120 min為細(xì)胞面積快速增長(zhǎng)期，120 min則進(jìn)入緩慢鋪展期。

Akt 是PI3K 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最經(jīng)典的效應(yīng)激酶之一，PI3K 誘導(dǎo)細(xì)胞膜磷脂酰肌醇的3'-OH 基團(tuán)磷酸化，招募Akt到細(xì)胞膜上并介導(dǎo)其激活。有文獻(xiàn)報(bào)道FN可以激活卵巢癌細(xì)胞[16]、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞[17]和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞[18]中的PI3K-Akt通路，而本研究發(fā)現(xiàn)FN以時(shí)間依賴的方式介導(dǎo)Akt 磷酸化，這與之前的研究結(jié)果一致。值得注意的是，F(xiàn)N 介導(dǎo)的Akt 磷酸化在60 min 時(shí)達(dá)到峰值，而FN 介導(dǎo)的細(xì)胞鋪展在120 min 時(shí)到達(dá)平臺(tái)期，這表明Akt的磷酸化與細(xì)胞鋪展存在時(shí)間上的先后順序，Akt 的激活早于細(xì)胞鋪展；同時(shí)Akt 的激活在120 min時(shí)已經(jīng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而細(xì)胞的完全鋪展幾乎在120 min 時(shí)完成，這表明Akt 激活和細(xì)胞鋪展又存在時(shí)間上的相關(guān)性，提示FN介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的潛在分子機(jī)制可能與PI3K-Akt激活有關(guān)。眾所周知PI3KAkt 信號(hào)通路在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、存活以及凋亡中發(fā)揮重要作用[19-20]，而我們應(yīng)用PI3K-Akt 抑制劑進(jìn)行干預(yù)的實(shí)驗(yàn)顯示：LY294002和渥曼青霉素都顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞鋪展，這表明FN誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞鋪展需要PI3K-Akt 信號(hào)的激活。盡管不同細(xì)胞的鋪展可能需要Syk[21]、局部黏著斑激酶[22]以及PI3K-Akt[23-24]等一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的協(xié)同作用，但使用FN作為細(xì)胞粘附底物的研究證實(shí)，PI3K-Akt 信號(hào)通路對(duì)成纖維細(xì)胞[23]和GD25 細(xì)胞[24]的鋪展至關(guān)重要，這與本研究的結(jié)果一致。

整聯(lián)蛋白通常由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，表達(dá)于細(xì)胞膜表面，作為ECM的受體與細(xì)胞外的ECM結(jié)合，不僅增強(qiáng)了細(xì)胞與基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度，還可以激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路[25]。而對(duì)FN而言，其整聯(lián)蛋白受體通常為αvβ3和α5β1，F(xiàn)N通過(guò)RGD 序列與細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白結(jié)合，因此細(xì)胞外給與RGDS 短肽可以抑制FN與其整聯(lián)蛋白受體的結(jié)合[10，26]。我們關(guān)于RGDS對(duì)Akt激活影響的實(shí)驗(yàn)表明，使用RGDS短肽封閉整聯(lián)蛋白可顯著抑制FN誘導(dǎo)的Akt磷酸化，表明FN介導(dǎo)的PI3K-Akt信號(hào)通路激活依賴整合素。與我們的結(jié)果相一致，多篇文獻(xiàn)證實(shí)PI3K-Akt 是FN 與整聯(lián)蛋白結(jié)合后激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[27-28]。隨后，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RGDS 顯著抑制了FN 誘導(dǎo)的HUVECs 鋪展，結(jié)合PI3K-Akt 抑制劑對(duì)細(xì)胞鋪展影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明FN通過(guò)整聯(lián)蛋白依賴的Akt激活介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鋪展。

4 結(jié)論

本研究探討了內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的潛在分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白依賴的Akt激活對(duì)FN介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞鋪展至關(guān)重要。這一結(jié)果提示FN-整聯(lián)蛋白-PI3K-Akt 信號(hào)通路可能是臨床實(shí)踐中治療和預(yù)防血管新生疾病的潛在靶點(diǎn)。

（利益沖突：無(wú)）