劉孟楠，羅鋼，陳立，楊思進

1.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 心血管內(nèi)科（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科（瀘州646000）；3.澳門科技大學 中醫(yī)藥學院（澳門 999078）

新型冠狀病毒肺炎簡稱新冠肺炎（corona virus dis?ease 2019，COVID-19）是一種由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）引起的傳染病，患者主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽和疲勞等[1-2]，除此之外，還會造成多個器官的損傷[3]及心理應激創(chuàng)傷[4]?；谥嗅t(yī)藥防治新冠肺炎的可觀療效，各省市相關(guān)機構(gòu)“三因制宜”陸續(xù)發(fā)布了中醫(yī)藥防治新冠肺炎的方案[5]。新冠0 號扶正辟邪方是由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院自行研發(fā)的用于新冠肺炎防治的中藥復方制劑，該藥品以免煎顆粒的形式進行發(fā)放及銷售。該藥組方為黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根[6]。現(xiàn)代藥理學研究表明該處方的多種藥物或有效成分具有抑制病毒及細菌的作用[7]。中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）是用于中草藥藥理學研究的網(wǎng)絡平臺，是目前進行網(wǎng)絡藥理學分析的主要研究工具，而網(wǎng)絡藥理學為中醫(yī)方劑的機理研究提供了一種新的途徑[8]。有研究報道新冠肺炎爆發(fā)的病源為冠狀病毒SARS-CoV-2[9]。本研究利用數(shù)據(jù)庫篩選新冠0號的有效生物活性成分和靶點，分析其治療新冠肺炎的關(guān)鍵靶點和信號通路；選取SARS-CoV-2 作為核心受體與新冠0 號篩選出的核心成分進行分子對接加以驗證，為進一步研究新冠0號及防治新冠肺炎提供指導。

1 材料和方法

1.1 新冠0號所含中藥化學成分相關(guān)靶點收集及篩選

通過TCMSP檢索新冠0號所含中草藥的所有有效成分，包括黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根；再以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18 為標準對化合物的藥物動力學進行篩選。運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫官方命名，將靶點基因的全稱轉(zhuǎn)換為簡稱，并刪除無對應基因名的靶點備用[10]。

1.2 新冠肺炎相關(guān)基因靶點收集及篩選

在Genecards數(shù)據(jù)庫中錄入關(guān)鍵詞“Novel coronavi?rus pneumonia”（新型冠狀病毒肺炎）收集疾病相關(guān)基因。

1.3 篩選新冠0號-新冠肺炎共同作用靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索新冠0號關(guān)鍵化學成分的靶點信息，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫查詢與靶點相對應的人類基因名稱，然后與上一步篩選出的新冠肺炎的蛋白靶點基因進行映射，得到藥物-疾病靶點基因[13]。

1.4 構(gòu)建中藥復方調(diào)控網(wǎng)絡

為了研究新冠0 號防治新冠肺炎的作用機制，本研究將新冠0 號-新冠肺炎的共同蛋白靶點基因?qū)隒ytoscape 3.8.2軟件進行可視化處理，將藥物-化合物-疾病靶點以網(wǎng)絡圖的形式呈現(xiàn)出來。在這個網(wǎng)絡圖中，鍵化合物和靶點以節(jié)點表示，節(jié)點之間相互作用的關(guān)系以邊來表示，以此篩選核心化合物[11]。以對應靶點數(shù)量超過10個的化合物作為核心化合物。

1.5 構(gòu)建蛋白互作用（PPI）網(wǎng)絡及核心基因篩選

以STRING數(shù)據(jù)平臺構(gòu)建新冠0號防治新冠肺炎靶蛋白PPI網(wǎng)絡，分析新冠0號防治新冠肺炎靶蛋白之間的相互作用。將藥物-疾病交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設為homo sapiens（人類），最低相互作用閾值設為medium confidence（中等置信程度0.4），其余參數(shù)保持默認設置，將所得網(wǎng)絡保存為TSV格式備用[11]。

1.6 篩選PPI網(wǎng)絡核心基因

在TSV文件中篩選PPI網(wǎng)絡中的核心基因，將TSV文件導入Cytoscape 3.8.2軟件，使用CytoNCA插件并選擇Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Local Average Conmectivity-based method、Network 作為評分依據(jù)，這些數(shù)值大小與該節(jié)點在網(wǎng)絡中的位置的重要性呈正相關(guān)，得到打分文件后取所有大于中位值的基因得到核心網(wǎng)絡，重復篩選2次，得到核心基因[11]。

1.7 GO功能分析和KEGG通路富集分析

通過Bioconductor 數(shù)據(jù)庫查詢藥物-疾病共同靶點基因的基因ID。利用R 語言安裝Bioconductor 平臺相關(guān)安裝包，設置pvalue=0.05，qvalue=0.05進行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制氣泡圖[12-13]。

1.8 分子對接驗證

將新冠肺炎的治療藥物α-干擾素、洛匹那韋、利托那韋、利巴韋林、磷酸氯喹和阿比多爾列為陽性對照藥物，于PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載以上陽性藥物及篩選出的核心化合物小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，使用ChemOffice軟件將其轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)；經(jīng)Auto Dock Tools加極性氫、分配電荷、設置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為pdbqt 格式文件；在PDB 數(shù)據(jù)庫中查找新冠肺炎的的核心基因SARSCoV-2（PDB ID:6LU7）作為蛋白受體；使用Py Mol 將靶蛋白和原始配體分離并去除水分子，將配體和受體導入Auto Dock Tools 軟件，分析其三維結(jié)構(gòu)活性部位，采集配體分子在受體活性口袋中的構(gòu)象模式；最后，使用Auto Dock Vina對接模型。配體與受體結(jié)合能越低，二者之間的結(jié)合就越穩(wěn)定，通常以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol作為標準以預測的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶之間的結(jié)合情況[14]。

2 結(jié)果

2.1 新冠0號-活性化合物網(wǎng)絡分析

根據(jù)化合物的OB和DL的特性，分別篩選出黃芪、銀花、廣藿香、連翹、貫眾、厚樸、白扁豆、薄荷、荊芥和蘆根中所含的化合物分別為16、17、9、17、5、2、1、8、1和10種，去重后共71 種化合物，見圖1 及表1；通過在Uniprot 數(shù)據(jù)庫分析轉(zhuǎn)換，將Targets 全稱轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，新冠0號所含的化合物共對應了249個基因。

表1 新冠0號所含有效化合物Table 1 Effective compounds contained in Xinguan No.0

圖1 新冠0號所含有效化合物網(wǎng)絡圖Figure 1 Network diagram of effective compounds contained in Xinguan No.0

2.2 新冠0號-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡圖

在GeneCards 中與新冠肺炎有關(guān)的靶點共438 個。將新冠0號對應的相應目標靶點數(shù)去重后，共獲得249個人源靶標蛋白；通過使用Venny 2.1在線工具尋找新冠0 號所含249 個復合相關(guān)靶點與438 個新冠肺炎相關(guān)靶點的交集，共獲得58個重疊基因（圖2）。將新冠0號的活性成分與其對應的疾病-藥物重合的靶點導入Cytoscape 3.8.2 形成新冠0 號-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡分析圖（圖3）。該網(wǎng)絡由115 個節(jié)點和297 個邊緣組成，其中以節(jié)點表示符合相關(guān)目標的活性化合物和目標蛋白，以邊緣表示活性化合物與目標蛋白之間的相互作用，以矩形的大小表示其連接數(shù)量的多少。在本次篩選中香葉木素（Diosmetin）存在于荊芥和薄荷中，β-胡蘿卜素（β-carotene）存在于白扁豆和銀花中，豆甾醇（Stigmasterol）荊芥、蘆根和銀花中，山柰酚（kaemp?ferol）存在于連翹、貫眾、黃芪和銀花中，β-谷甾醇（βsitosterol）存在于荊芥、連翹和銀花中，槲皮苷（querce?tin）存在于荊芥、連翹、黃芪、廣藿香和銀花中，木樨草素（luteolin）存在于荊芥、連翹、銀花和薄荷中；在這些靶點中，以相互連接的數(shù)目進行排名，連接超10 個的包括：槲皮苷，共涉及43 個靶點，木樨草素共涉及22個，漢黃芩素（wogonin）共涉及18個，山柰酚共涉及14個，依立酮（irisolidone）共涉及12個，刺槐素（acacetin）和柚皮素（naringenin）各涉及11個，異鼠李素（isorham?netin）和花黃素（formononetin）各涉及10個靶點。這表明新冠0 號配方中的化合物可能共同作用于這些靶點，在防治新冠肺炎中發(fā)揮藥理作用。

圖2 新冠0號靶點與新冠肺炎靶點交集韋恩圖Figure 2 Venn diagram of intersection of Xinguan No.0 target and COVID-19 target

圖3 新冠0號-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡圖Figure 3 Network diagram of Xinguan No.0-compound-disease target

2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建

將58 個藥物-疾病重疊的基因提交給STRING 數(shù)據(jù)庫，隱藏游離點，最低相互作用閾值設為中等置信程度。獲得了由58 個PPI 網(wǎng)絡目標基因，即由58 個節(jié)點和748 個邊緣組成的網(wǎng)絡關(guān)系，見圖4，邊緣代表蛋白之間的相關(guān)程度。在STRING 中下載TSV 文件，導入Cytoscape 3.8.2 軟件，使用CytoNCA 對TSV 文件進行PPI 網(wǎng)絡分析得到核心基因網(wǎng)絡，最終篩選出11 個核心基因，包括PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8、CASP3、TP53、CCL2、MAPK3、MAPK1、MAPK14和CXCL8（圖5），這些可能是防治新冠肺炎的重要靶點。

圖4 新冠0號與新冠肺炎作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖Figure 4 Network diagram of interaction between Xinguan No.0 and target proteins of COVID-19

圖5 新冠0號防治新冠肺炎核心蛋白靶點篩選圖Figure 5 Screening map of core protein targets for prevention and treatment of COVID-19 in Xinguan No.0

2.4 新冠0 號防治新冠肺炎作用靶點基因本體（GO）富集與KEGG通路富集分析

為了進一步闡明58個候選靶點的可能作用，對新冠0 號防治新冠肺炎的158 個候選靶點進行GO 富集分析和KEGG 生物途徑分析。得到生物過程（biologi?cal process，BP）條目2015個，細胞組成（cellular compo?nent，CC）條目41 和分子功能（molecular function，MF）條目124個，其中各組排名前10的條目見圖6。在生物過程中，對脂多糖應答，對細菌來源分子的反應，細胞對生物刺激的反應等排位靠前；在細胞組成中對膜筏、膜微區(qū)和膜的調(diào)控等排在前面；在分子功能中與細胞因子受體結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性及信號受體激活物的活性等密切相關(guān)。KEGG 生物途徑分析出與之相關(guān)的信號途徑功166條，取排名前30 的條目見圖7。結(jié)果顯示，糖尿病并發(fā)癥的年齡-年齡信號通路、人巨細胞病毒感染和神經(jīng)退行性變途徑-多種疾病通路及多種病毒、炎癥相關(guān)通路與新冠0 號防治新冠肺炎的機制有關(guān)。

圖6 新冠0號防治新冠肺炎作用靶點GO富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 inprevention and treatment of COVID-19

圖7 新冠0號防治新冠肺炎作用靶點KEGG富集分析Figure 7 KEGG enrichment analysis of targets of Xinguan No.0 in prevention and treatment of COVID-19

2.5 新冠0號防治新冠肺炎活性成分分子對接

將SARS-CoV-2 作為核心受體對新冠0 號-化合物-疾病網(wǎng)絡中的核心化合物及陽性對照藥物進行分子對接。分子對接結(jié)果顯示新冠0號的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點對接的親和力均小于-5.0 kcal/mol，由此表明預測的新冠0號關(guān)鍵活性成分與防治新冠肺炎的關(guān)鍵作用靶點具有較好的結(jié)合活性，與網(wǎng)絡藥理學篩選結(jié)果一致，驗證了網(wǎng)絡藥理學具有一定的可靠性，見表2。

表2 新冠0號核心化合物及陽性對照藥與SARS-CoV-2的分子對接Table 2 Molecular docking of SARS-CoV-2 and core compound and positive control drug in Xinguan No.0

3 討論

新冠0 號組方以黃芪、銀花為君藥，重用黃芪，方以益氣固表，御邪于外，銀花清熱解毒、補氣祛邪，二者聯(lián)用相得益彰[15-17]；廣藿香、連翹、貫眾及厚樸共為臣藥，四藥相配取其清熱解毒，輕宣透表之功[18]；荊芥解表祛風，薄荷疏風清熱而清利頭目，厚樸、白扁豆運脾燥濕，下氣和中，此四味同為佐藥[19]；蘆根為使藥，其性甘而寒，可清熱生津，滋肺清肺，取引經(jīng)入肺之效[20]。諸藥共用，共奏益氣解毒、清熱化濁之功?，F(xiàn)代藥理學研究證實黃芪有效成分黃芪甲苷具有包括誘導T細胞活化，調(diào)節(jié)效應子/調(diào)節(jié)T 細胞平衡，增強CD45 磷酸酶活性，抑制促炎細胞因子及免疫刺激的作用[16，21]；酸和類黃酮提取物是金銀花主要的抗病毒活性成分，其黃酮提取物對H7N9 流感病毒抑制作用最強[17，22]；此外，已逐步驗證廣藿香、薄荷、荊芥及蘆根等的有效成分化合物均有不同程度的抗病毒作用[18-20]。新冠0 號自批準配置以來共生產(chǎn)銷售和發(fā)放近3 萬劑，在2020 年3月疫情較為嚴重的階段起到了保健康、穩(wěn)人心的重要作用，對四川省疫情的防控作出了較大貢獻[9]。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集新冠0號化合物成分共71個，對應靶點數(shù)為249個，其中與新冠肺炎共同的靶點數(shù)有58個，如篩選出的核心靶點PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3等，此外還有包括白介素在內(nèi)的多種炎性因子。有研究表明，SARS-CoV-2 病毒感染將啟動機體的炎癥反應、感染、細胞凋亡等病理過程，免疫力低下的群體感染病毒后會引發(fā)體內(nèi)免疫細胞分泌大量炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 和IFN-α等，這種因人體免疫系統(tǒng)過度激活導致的細胞因子風暴（cytokine storm）是引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和多臟器功能失常綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要原因，亦是新冠病毒致死的主要原因之一。已有文獻報道新冠0號的有效化學成分具有提高人體免疫力、抗炎及抗感染的作用，運用中醫(yī)理論解釋其組方的科學性亦表明了該處方具有“御邪于外”“扶正祛邪”的防治效果[23]。

SARS-CoV-2 屬于β-冠狀病毒，內(nèi)含大量非結(jié)構(gòu)蛋白。目前已有研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）能夠作為該病毒的宿主細胞受體，抑制病毒與受體的結(jié)合具有潛在的治療意義[24]。研究人員通過計算機輔助藥物設計鑒定了一種基于SARS-CoV-2 的有效抑制劑N3，基于結(jié)構(gòu)的虛擬和高通量篩選相結(jié)合所篩選的靶向藥物對于防治新冠肺炎具有重要意義[9]。根據(jù)“新冠0 號-化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡圖選取槲皮苷、木樨草素、漢黃芩素和山柰酚等超過10 個連接基因的化合物作為核心化合物配體與受體SARS-CoV-2 進行分子對接，結(jié)果顯示這9 種化合物與受體均具有較好的結(jié)合能，表明其作為藥物進入人體后能與該受體進行結(jié)合的可能性大因此存在潛在的作用價值。槲皮苷、木樨草素、依立酮、刺槐素和花黃素與SARS-CoV-2 的結(jié)合能均≤7 kcal/mol，表明其發(fā)生作用的可能性更大，表明新冠0號具有抑制SARS-CoV-2 病毒的潛在能力，起到治療COVID-19 的作用，這些觀點在柴胡達原飲、玉屏風散等中醫(yī)藥防治新冠肺炎的研究中亦得到了類似的結(jié)論[25-27]。雖然陽性對照藥物如洛匹那韋、利托那韋、利巴韋林和阿比多爾都顯示出了較好的結(jié)合活性，其確切的作用機制和療效擁有一定的循證醫(yī)學證據(jù)支撐，但根據(jù)文獻報道使用大劑量的抗病毒治療產(chǎn)生的藥物副作用可能會對人體產(chǎn)生不可逆的損傷[28-30]。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點、雙向調(diào)節(jié)、副作用少等優(yōu)勢特點，其在防治新冠肺炎中還具有更大的潛力亟待挖掘[31]。

4 結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接的方法從“藥物-疾病-靶點”角度探討新冠0號防治新冠肺炎的分子機制。分析結(jié)果表明新冠0 號可通過槲皮苷、木樨草素、漢黃芩素、山柰酚和依立酮等成分作用于新冠病毒靶點SARS-CoV-2 及機體PTGS2、VEGFA、ICAM1、MAPK8 和CASP3 等因子，影響多條病毒及炎癥相關(guān)通路活性以起到防治新冠肺炎的作用。本研究初步確定了新冠0 號通過靶向SARS-CoV-2 防治新冠肺炎的的科學性，基本明確了該處方的有效成分組成，為臨床合理應用及防治新冠病毒感染提供了有價值的理論依據(jù)。

（利益沖突：無）