文靖，周宇，李勝杰，李沛東，薛源，張廣軍

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外二科，四川 南充 637000； 2.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸病研究所，四川 南充 637000)

結(jié)腸慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)系以結(jié)腸功能失調(diào)、傳導(dǎo)異常導(dǎo)致的腸道運(yùn)輸能力減弱為特征的頑固性便秘，主要臨床表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難、糞便干結(jié)、腹脹，甚至可引起一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。當(dāng)今社會(huì)，隨著人們生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)及習(xí)慣的改變，加之社會(huì)及生理因素的影響，STC的發(fā)生率逐年增加[2]。STC是功能性便秘的常見(jiàn)類型，占功能性便秘的10.3%～45.5%[3]。近年來(lái)，對(duì)于STC的發(fā)病原因及機(jī)制研究逐漸增多，包括腦腸肽、腸道菌群、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)、精神因素等異常。它是一個(gè)多病因機(jī)制參與的病理過(guò)程，故對(duì)于其治療方案尚未統(tǒng)一，臨床首選藥物保守治療及良好生活習(xí)慣的轉(zhuǎn)變；內(nèi)科治療效果不佳時(shí)，需積極行腸段切除吻合、回腸造口等外科手術(shù)治療，但手術(shù)治療常會(huì)引起便秘復(fù)發(fā)、腹瀉、梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥[4]。當(dāng)前，仍沒(méi)有理想的方法來(lái)有效治療難治性STC，迫切需要新的療法來(lái)加速結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)及康復(fù)[5]。而進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)驗(yàn)常以動(dòng)物模型為研究基礎(chǔ)，故需要設(shè)計(jì)與構(gòu)建合理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，以期更好地復(fù)制動(dòng)物STC模型?，F(xiàn)就STC動(dòng)物模型的研究進(jìn)展予以綜述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

目前，國(guó)內(nèi)外便秘相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍主要以小鼠、大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，也有越來(lái)越多的學(xué)者利用犬、兔、豬等大動(dòng)物建立STC動(dòng)物模型，以滿足相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)需求。其中，大鼠作為制備便秘模型的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便、耐受及抵抗能力較小鼠強(qiáng)、易獲得、繁殖能力強(qiáng)，解剖結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)與人類相似等；小鼠亦有價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛，品系純等優(yōu)點(diǎn)，但小鼠耐受及抵抗力較大鼠差，不適合長(zhǎng)期灌胃給藥造模，因此小鼠在STC造模應(yīng)用中受到一定程度的限制[6]。小鼠因體型較小，腸道較短，更適合觀察排便實(shí)驗(yàn)；大鼠因腸道較長(zhǎng)，產(chǎn)生的糞便相對(duì)更多，更利于腸道水吸收相關(guān)實(shí)驗(yàn)，而小鼠、大鼠均可以用于胃腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)[7]。有研究表明，慢傳輸型便秘的發(fā)病機(jī)制可能與孕酮或雌激素有關(guān)[8-9]，為避免孕酮或雌激素的干擾，故在鼠類性別選擇上以雄性鼠類為宜。

近年來(lái)，隨著研究的深入出現(xiàn)多種STC治療手段，如胃結(jié)腸電刺激、神經(jīng)刺激、針灸治療、外科手術(shù)等，由于這些操作復(fù)雜，需要使用STC大動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[10]。有學(xué)者在研究結(jié)腸電刺激對(duì)STC動(dòng)物模型排便及胃腸傳輸功能影響時(shí)，采取犬為研究對(duì)象，因其與人的消化系統(tǒng)性質(zhì)類似且體積較大，故可以使用與人體基本相同的儀器設(shè)備進(jìn)行研究，以利于電刺激在人體的應(yīng)用、刺激器的升級(jí)開(kāi)發(fā)及人體適宜的模式和參數(shù)的選擇[11]。王欣月[12]選用成年的普通級(jí)健康家兔(2.5～3.5 kg)，采用復(fù)方地芬諾酯混懸液經(jīng)口灌胃的方法成功制作了便秘模型。Zhu等[13]通過(guò)制作豬STC模型對(duì)胃腸道電刺激系統(tǒng)進(jìn)行了相關(guān)研究。

2 動(dòng)物模型的構(gòu)建

目前，STC動(dòng)物模型的經(jīng)典造模方法包括藥物(復(fù)方地芬諾酯、洛哌丁胺、阿片類藥物、大黃、酚酞等)造模法、物理刺激(活性炭冰水灌胃、限水限食等)造模法、藥物聯(lián)合低纖維飲食等[14]。隨著研究者對(duì)STC研究的不斷深入及經(jīng)典造模方法的不斷改進(jìn)，逐漸出現(xiàn)了一系列新的造模方法，如通過(guò)誘導(dǎo)腸道菌群紊亂建立便秘模型、牛奶造模、通過(guò)化學(xué)消融法建立STC大鼠模型等?，F(xiàn)對(duì)不同造模方法介紹如下。

2.1復(fù)方地芬諾酯造模法 復(fù)方地芬諾酯片是臨床常見(jiàn)的一種止瀉藥物，含鹽酸地芬諾酯及硫酸阿托品兩種組分。其中地芬諾酯屬于哌替啶類藥物，能作用于結(jié)腸平滑肌，可通過(guò)抑制結(jié)腸黏膜感受器消除結(jié)腸黏膜局部的蠕動(dòng)反射，從而減弱結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能，同時(shí)還可增加結(jié)腸的節(jié)段性收縮，明顯延長(zhǎng)結(jié)腸內(nèi)容物通過(guò)時(shí)間,增加結(jié)腸內(nèi)水分的吸收，使大便干結(jié)[15]。阿托品是腸道M型受體阻斷劑，其與腸道M型受體結(jié)合后可抑制腸道平滑肌收縮，導(dǎo)致腸蠕動(dòng)減慢及糞便干燥。顧志堅(jiān)等[16]用復(fù)方地芬諾酯片[15 mg/(kg·d)]給大鼠灌胃2周，最終大鼠出現(xiàn)了24 h糞便數(shù)量減少、糞便重量減輕，成功建立了大鼠STC模型，該模型具有良好的操作性及可重復(fù)性，可在一定程度上避免停用建模藥物后便秘恢復(fù)情況，造模周期較短，是一種相對(duì)簡(jiǎn)便的STC模型。

2.2洛哌丁胺造模法 STC動(dòng)物模型多依賴化學(xué)藥物影響胃腸傳輸，洛哌丁胺與復(fù)方地芬諾酯藥理作用類似，也是國(guó)內(nèi)外STC研究中常用的一種建模藥物。洛哌丁胺可抑制腸道平滑肌的收縮，減少腸蠕動(dòng)，延長(zhǎng)腸內(nèi)容物排出時(shí)間，促進(jìn)水的重吸收，無(wú)中樞抑制作用且藥物基本上不進(jìn)入血液循環(huán)，安全性較高，故較為常用[17]。Deng等[18]采用5.0 mg/kg鹽酸洛哌丁胺每日2次連續(xù)腹腔內(nèi)注射5 d，制造了相對(duì)穩(wěn)定的STC大鼠模型。Chen等[19]于每天9:00給小鼠喂食洛哌丁胺(10 mg/kg)，持續(xù)4周，成功誘導(dǎo)小鼠便秘。

2.3阿片類藥物造模法 目前阿片類藥物誘導(dǎo)便秘的具體機(jī)制尚不清楚，可能為μ阿片受體在整個(gè)胃腸道中均普遍表達(dá)，阿片類藥物與之結(jié)合后會(huì)減少腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而減弱腸道的動(dòng)力、減少腸液的分泌，并增加腸液的重吸收，從而誘導(dǎo)STC形成[20]。許海塵等[21]給予小鼠每天皮下注射鹽酸嗎啡(2.5 mg/kg)，共持續(xù)45 d，結(jié)果顯示小鼠 24 h糞便重量減輕減少、腸道蠕動(dòng)減弱、c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，并推測(cè)其誘導(dǎo)STC的機(jī)制與內(nèi)源性阿片肽增多或腸道ICC異常改變有關(guān)。由于嗎啡類屬于管制性藥物且造模周期較長(zhǎng)，這種造模方法并不常用。

2.4低纖維飲食聯(lián)合藥物造模法 誘發(fā)慢性功能性便秘的原因很多，飲食中缺乏膳食纖維、水分不足是產(chǎn)生便秘的重要影響因素[22]。其中膳食纖維可以充當(dāng)腸道內(nèi)的保水固體，缺乏膳食纖維可導(dǎo)致糞便排泄不暢，并儲(chǔ)存在結(jié)腸，誘發(fā)便秘[23]。李雪等[24]單純利用玉米、奶酪、蔗糖、糊精、植物油等低纖維飲食以不同比例混合飼養(yǎng)大鼠2個(gè)多月，建立了STC大鼠模型。低纖維飲食造模的優(yōu)點(diǎn)為低纖維便秘動(dòng)物模型可以很好地模擬非病理性因素及不良飲食習(xí)慣引起的便秘，不僅可避免化學(xué)藥物便秘模型中藥物所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，而且對(duì)高膳食纖維配方產(chǎn)品的通便療效評(píng)價(jià)更為合理恰當(dāng)[23]。但單純低纖維飲食造模存在時(shí)間長(zhǎng)、腸道功能易恢復(fù)等缺點(diǎn)，有學(xué)者推薦低纖維飲食聯(lián)合藥物造模。朱丹等[10]給予犬喂食罐頭肉以及苯乙氧基化物和鹽酸阿洛司瓊，持續(xù)5周，成功建立了符合臨床癥狀和病理變化的STC犬模型，可用于觀察和評(píng)價(jià)電刺激和手術(shù)等治療效果。

2.5誘導(dǎo)腸道菌群紊亂造模法 既往有研究表明，STC的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)有密切關(guān)系[25]。在此基礎(chǔ)上，胡琴[26]利用濃度為 62.5 mg/ml的克拉霉素、阿莫西林等抗生素混合液持續(xù)小鼠灌胃4 d，后予以125 mg/ml的抗生素混合液繼續(xù)灌胃3 d的方法來(lái)誘導(dǎo)小鼠腸道菌群紊亂，從而成功建立了腸道菌群紊亂型便秘小鼠模型。黃璐[27]選用C57BL/6小鼠作為造模對(duì)象，首先用廣譜抗生素清除小鼠體內(nèi)的原有腸道微生物，構(gòu)建“偽無(wú)菌鼠”模型，再將STC患者的糞便菌群移植到“偽無(wú)菌鼠”模型中，最后觀察發(fā)現(xiàn)菌群移植后小鼠的癥狀與STC的臨床癥狀相似。通過(guò)誘導(dǎo)腸道菌群紊亂建立的STC動(dòng)物模型常用于腸道菌群對(duì)STC影響的研究及相關(guān)藥物藥效評(píng)價(jià)等；此種造模方法雖然較簡(jiǎn)單且造模周期較短，但模型易受環(huán)境、食物等影響，易恢復(fù)、不穩(wěn)定。

2.6牛奶造模法 牛奶中的蛋白質(zhì)及脂肪等主要組成成分可促進(jìn)促胰液素、抑胃肽等的分泌，同時(shí)抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，所以過(guò)多飲用牛奶易導(dǎo)致便秘[28]。蔡云清等[29]進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，牛奶可能會(huì)增加老年人慢性便秘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，張文仁[7]提出了利用70%的牛奶連續(xù)飼養(yǎng)小鼠7 d的牛奶造模法，其造模原理可能為小鼠過(guò)量攝入蛋白，造成腸道負(fù)荷過(guò)重或蛋白質(zhì)代謝后產(chǎn)生大量堿性物質(zhì)，從而打破腸道酸堿平衡，引起便秘。該造模方法雖然具有操作簡(jiǎn)單、造模周期短等優(yōu)點(diǎn)，但目前應(yīng)用較少，非常規(guī)造模方法，需要進(jìn)一步的探究與驗(yàn)證。

2.7化學(xué)消融造模法 STC的病理機(jī)制與腸神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。馬春星等[30]選用SD雌性大鼠在麻醉下進(jìn)行腹腔手術(shù)，分別用不同濃度的苯扎氯銨溶液處理全結(jié)腸30 min，術(shù)后2周觀察大鼠相關(guān)結(jié)腸動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸運(yùn)輸時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且與苯扎氯銨濃度呈正相關(guān)。相關(guān)機(jī)制可能為化學(xué)藥物苯扎氯銨對(duì)結(jié)腸神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行破壞、消融，從而影響多種腸神經(jīng)遞質(zhì)的合成與分泌，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、P物質(zhì)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，最終導(dǎo)致結(jié)腸傳輸功能減弱及便秘。此種造模方法雖然操作過(guò)程較復(fù)雜，但模型效果較穩(wěn)定，有利于STC與腸神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系的深入研究。

3 STC動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

3.1一般情況觀察 一般情況觀察是指對(duì)動(dòng)物的活動(dòng)量、精神情況、毛色、大便數(shù)量及質(zhì)地等情況進(jìn)行觀察記錄。有研究發(fā)現(xiàn)，STC模型組動(dòng)物最初有腹脹狀態(tài)，后逐漸出現(xiàn)倦怠，活動(dòng)量顯著減少，毛發(fā)蓬松無(wú)光澤，好蜷縮于飼養(yǎng)籠一端，反應(yīng)緩慢，抓取時(shí)抵抗減弱，食欲減弱，大便黑、短小且干燥，排便次數(shù)減少，體重明顯減輕，造模后期STC模型組動(dòng)物明顯瘦弱，觸之覺(jué)皮毛松弛，無(wú)肉；造?；謴?fù)后，STC模型組動(dòng)物各項(xiàng)表現(xiàn)逐漸恢復(fù)正常[31]。

3.2胃腸道傳輸功能檢測(cè) 胃腸道傳輸功能檢測(cè)通常包括首粒大便排出時(shí)間、24 h糞便數(shù)量及糞水含量、腸道推進(jìn)率。受到動(dòng)物腸道內(nèi)糞便量及胃內(nèi)食物殘留量的影響，首粒大便排出時(shí)間并不一定能精確地反映胃腸道的傳輸情況；這時(shí)可利用酚紅、活性炭等有色且不易被消化的物質(zhì)灌胃，評(píng)估胃腸的運(yùn)動(dòng)[14]。首粒大便排出時(shí)間明顯延遲是造模成功的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。首粒大便排出時(shí)間受到個(gè)體差異、內(nèi)外環(huán)境的影響而出現(xiàn)誤差，所以通常會(huì)收集STC動(dòng)物模型24 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間的大便來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。STC伴糞便干結(jié)，故糞水含量也成為造模成功與否的常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。采集大鼠新鮮糞便，先稱糞便的濕重，將其烘干后稱糞便的干重，糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%[32]。造模成功后，模型組會(huì)出現(xiàn)24 h糞便數(shù)量減少及糞水含量降低。將小鼠解剖后，在無(wú)張力狀態(tài)下測(cè)量腸道全長(zhǎng)(L1)和有色物質(zhì)在腸道的推進(jìn)距離(L2)，則腸道推進(jìn)率(D)=L2/L1×100%[33]。腸道推進(jìn)率反映了腸道傳輸能力，STC模型組的推進(jìn)率低于正常組時(shí)，說(shuō)明造模有效。

3.3ICC及c-kit的檢測(cè) 腸道中ICC數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)異常會(huì)影響結(jié)腸蠕動(dòng)功能，從而引起便秘的發(fā)生[34]。c-kit蛋白分子是ICC最重要的識(shí)別標(biāo)記，它會(huì)影響ICC的功能[35]。通過(guò)蛋白免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，STC模型組小鼠的結(jié)腸ICC基膜在結(jié)腸壁上溶解，ICC與其周圍細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)被破壞，ICC細(xì)胞核呈不同程度固縮，且ICC數(shù)量和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞較正常對(duì)照組顯著減少[36]。通過(guò)免疫熒光技術(shù)及透射電鏡檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，STC模型大鼠腸道內(nèi)ICC數(shù)量可能由于鈣離子介導(dǎo)的自噬而顯著減少，雖形成網(wǎng)絡(luò)狀，但能觀察到ICC密度變得稀薄，細(xì)胞形狀窄而細(xì)[37]。

3.4在體結(jié)腸肌電測(cè)定 結(jié)腸平滑肌動(dòng)作電位(亦稱快波)是促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)前進(jìn)的主要?jiǎng)恿?，而?dòng)作電位產(chǎn)生于慢波之上，慢波控制結(jié)腸平滑肌收縮節(jié)律、方向等，因此可以借助電生理技術(shù)分析檢測(cè)STC動(dòng)物模型的結(jié)腸慢波頻率及振幅，從而評(píng)估結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)傳輸功能[14]。有研究表明，正常大鼠結(jié)腸慢波表現(xiàn)為近似正弦波樣曲線，振幅較整齊，而STC大鼠結(jié)腸慢波頻率較正常大鼠明顯減慢，頻率變異系數(shù)增大，振幅明顯增加，振幅變異系數(shù)增大[38]。劉海峰等[39]通過(guò)對(duì)STC大鼠模型進(jìn)行在體結(jié)腸肌電檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，慢波頻率及振幅異常可能導(dǎo)致腸道推進(jìn)率發(fā)生改變或收縮不協(xié)調(diào)，慢波振幅的改變可能導(dǎo)致峰電位發(fā)放減少，而峰電位異常可能對(duì)結(jié)腸收縮產(chǎn)生影響，如表現(xiàn)為結(jié)腸運(yùn)動(dòng)能力減弱，腸道傳輸功能下降。故在體結(jié)腸肌電檢測(cè)對(duì)STC模型的評(píng)價(jià)起重要作用。

3.5離體結(jié)腸肌力檢測(cè) STC系指結(jié)腸收縮運(yùn)動(dòng)障礙，表現(xiàn)為結(jié)腸內(nèi)容物推進(jìn)速度減慢或結(jié)腸收縮乏力[40]。與在體結(jié)腸肌肌電測(cè)定一樣，離體結(jié)腸肌力檢測(cè)亦是評(píng)估STC模型效果的一種指標(biāo)，但離體結(jié)腸肌力檢測(cè)在體外進(jìn)行，避免了體內(nèi)環(huán)境的影響，特別是一些胃腸肽的干擾。麻醉成功后取模型動(dòng)物一段結(jié)腸組織制備成結(jié)腸肌條，將其放在37 ℃含克雷布斯-林格緩沖液的器官浴中待測(cè)定；施予結(jié)腸肌條一定的初始張力，用卡巴膽堿或氯化鉀刺激其收縮，最后用生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄及分析離體腸道肌力信號(hào)強(qiáng)度，從而評(píng)估STC動(dòng)物模型腸道收縮運(yùn)動(dòng)能力[41]。STC動(dòng)物模型常表現(xiàn)為離體結(jié)腸肌力減弱的特性。

3.6NO、VIP和P物質(zhì)的測(cè)定 NO及VIP均是一種腸道抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可通過(guò)擴(kuò)散的方式進(jìn)入腸道平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)平滑肌舒張，從而抑制腸蠕動(dòng)，減弱腸動(dòng)力[42-43]。Zhu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，STC組的血清NO和VIP水平升高，利用有效藥物白芍總苷治療后血清NO和VIP水平降低；推測(cè)其機(jī)制可能為白芍總苷通過(guò)減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(NO和VIP)促進(jìn)腸蠕動(dòng)。有研究證實(shí)，P物質(zhì)是一種由腸神經(jīng)元分泌的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)與腸神經(jīng)元上的速激肽NK1受體偶聯(lián)來(lái)調(diào)節(jié)ICC的起搏器電流，從而正向調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)[45]?？梢?jiàn)，這些腦腸肽物質(zhì)與腸道運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，可通過(guò)對(duì)NO、VIP及P物質(zhì)等進(jìn)行直接檢測(cè)來(lái)間接反映腸道功能情況，操作簡(jiǎn)單方便；但由于STC的影響因素眾多且病因機(jī)制不明確，不能僅依靠這些腦腸肽物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)STC模型成功與否，而常作為一種次要性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

4 小 結(jié)

STC動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)與構(gòu)建理念應(yīng)遵循臨床STC的發(fā)病機(jī)制。在動(dòng)物選擇上，目前仍主張選用鼠、犬、兔等與人類消化系統(tǒng)相似的動(dòng)物，但動(dòng)物的生活習(xí)性及STC動(dòng)物模型的發(fā)病機(jī)制仍與人類STC有顯著差異；在造模方法上，除上述常見(jiàn)的造模方法外，還出現(xiàn)了一些特殊的造模方法，如ICC缺失型STC動(dòng)物模型[46]及利用基因敲除技術(shù)建立神經(jīng)菌毛蛋白1缺失型STC動(dòng)物模型[41]等。隨著社會(huì)的發(fā)展，“生理-心理-社會(huì)模式”在便秘發(fā)生發(fā)展中起重要作用，這也對(duì)STC動(dòng)物模型的構(gòu)建方法提出了更高要求，而不再單純依靠化學(xué)藥物。在STC動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)上，隨著“腦-腸軸”在便秘研究中的不斷深入，腦腸肽分子可能成為今后評(píng)價(jià)STC的熱點(diǎn)。目前關(guān)于STC的病理機(jī)制研究愈來(lái)愈廣泛，因研究目的及方法不同，構(gòu)建的動(dòng)物模型也不盡相同，力求構(gòu)建簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)及科學(xué)的動(dòng)物模型，使人類的STC能在動(dòng)物模型上更好的復(fù)制。