鄒 游, 邵琳智, 藍 草, 陳思敏

(廣州海關技術中心食品與化妝品檢測研究所, 廣東 廣州 510623)

復合硝基酚鈉也稱復硝酚鈉,是幾種含硝基苯酚鈉鹽(有的產品是銨鹽)的復合型植物生長調節(jié)劑,最早于20世紀90年代由日本旭化學工業(yè)株式會社研發(fā),商品名為“愛多收”“愛豐收”和“Atonik”,由5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(5NG)、對硝基酚鈉(PNP)和鄰硝基酚鈉(ONP)按照一定比例構成[1]。因具有高效、低毒、廉價等優(yōu)點,復硝酚鈉在農業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)領域適用非常廣泛,既可單獨使用,也可作為增效劑與農藥、肥料、飼料等配合使用。與飼料復配使用時,復硝酚鈉能促進動物的食欲及其對營養(yǎng)的吸收,加快生長發(fā)育,同時增強動物的免疫能力,提高肉、蛋、奶、皮、毛的產量和質量[2-4]。近年來有研究表明,植物生長調節(jié)劑在農作物中的殘留通過食物鏈進入人體會造成一定程度的危害。復硝酚鈉雖然毒性較低,但長期食用含復硝酚鈉殘留的動植物食品仍對人體健康存在潛在危害。美國環(huán)保局(EPA)已將鄰硝基酚和對硝基酚列為“優(yōu)先控制污染物”[5],對硝基酚也被列入中國優(yōu)先控制污染物黑名單[6]。歐盟委員會發(fā)布(EU)2021/590號條例,修改制定了復硝酚鈉在某些產品中的最大殘留限量[7],在作為商品銷售的豬、牛、羊、馬、家禽等可食用組織中復硝酚鈉的最大殘留限量(以5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、對硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉之和計,并以5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉表示)均為0.03 mg/kg。2019年底,我國農村農業(yè)部250號公告也正式將復硝酚鈉列入食用動物禁止使用的藥品及其他化合物清單[8]。

目前,國內尚未有農畜產品中復硝酚鈉殘留監(jiān)控的檢測標準。查閱已發(fā)表的文獻,復硝酚鈉在動物源食品中的檢測方法大多為氣相色譜法和高效液相色譜法。其中,氣相色譜法需對樣品進行酸化或衍生化后才能測定[9],前處理復雜,準確度較低,報道的定量限較高,均為10 μg/kg;高效液相色譜法是檢測復硝酚鈉比較常用的方法[10,11],但現(xiàn)有文獻報道的方法普遍存在樣品分析時間長、靈敏度較低等問題,且僅報道了檢出限,不能滿足定量檢測的要求。相比而言,液相色譜-串聯(lián)質譜法在檢測動物樣品中的藥物殘留特別是在禁用藥物的痕量分析中具有更好的靈敏性和更高的特異性[12-17],但卻幾乎無人用于復硝酚鈉中3種組分的同時檢測。原因在于ONP的分子結構中,硝基基團的氧原子與鄰位酚羥基的氫原子形成分子內氫鍵,使酚羥基的氫原子不易被電離,導致了ONP的極性極弱,在電噴霧電離(ESI)模式下的靈敏度比其余兩個組分低了3個數(shù)量級,從而影響整個方法的靈敏度[18]。然而,大氣壓化學電離(APCI)與電噴霧電離的原理不同,主要用于弱極性和小分子化合物的分析。Xing等[19]采用了帶APCI源的高效液相色譜-串聯(lián)質譜對水產品中的復硝酚鈉進行痕量分析,靈敏度很高。

本研究采用堿性溶液提取樣品,去除大部分水溶性雜質,后續(xù)通過調節(jié)pH值、乙腈反萃、正己烷脫脂凈化,能有效避免樣品提取過程中雜質的干擾,減少基質效應(ME),再以APCI為電離方式,建立了高效液相色譜-大氣壓化學電離-串聯(lián)質譜法同時對復硝酚鈉3種組分進行測定,以提高方法的正確度和靈敏度,為制定標準提供了較為可靠的參考依據(jù),填補了動物源食品中復硝酚鈉殘留量測定的技術空白,具有廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500三重四極桿質譜儀,帶大氣壓化學電離源,Analyst儀器控制及Multiquant數(shù)據(jù)處理軟件(美國SCIEX公司); UFLC-XR液相色譜儀(包括輸液泵LC-20AD、自動進樣器SIL-20AC、柱溫箱CTO-20AC)(日本島津公司); BT223S型電子天平(德國Sartorius公司); 3-30K高速離心機(美國Sigma-Aldrich公司); Biotage Turbo Vap氮吹儀(南京新飛達光電科學技術有限公司); MS 3 basic渦旋混合器(德國IKA公司)。

5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(CAS號:67233-85-6,純度:96.15%)、對硝基苯酚鈉(CAS號:824-78-2,純度:80.47%)(德國Ehrenstorfer公司);鄰硝基苯酚鈉(CAS號:824-39-5,純度:99.9%,北京曼哈格生物科技有限公司);乙腈、甲醇(HPLC級,美國Fisher Scientific公司);鹽酸(優(yōu)級純,廣州化學試劑廠);實驗室用水為一級水(符合GB/T 6682-2008一級水要求);其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 樣品的前處理

1.2.1提取

稱取樣品2.00 g(精確至±0.02 g)于50 mL離心管中,加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,在渦旋混合器上混勻30 s后,振蕩提取15 min,以3 mol/L的鹽酸溶液調整pH至3.0后加入5.0 g氯化鈉,渦旋1 min,再加入8 mL乙腈,振蕩提取20 min,以4 000 r/min離心5 min。取上清液于另一50 mL離心管中,殘渣繼續(xù)加入8 mL乙腈,振蕩提取20 min后以4 000 r/min離心5 min,合并上清液,備用。

1.2.2凈化

在備用液中先加入5 mL飽和氯化鈉溶液,再加入10 mL正己烷,振蕩后以4 000 r/min離心5 min,取中間乙腈層于15 mL離心管中,于40 ℃下氮吹至約1.5 mL后加一級水定容至3 mL,以0.2 μm濾膜過濾,供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

CORTECT C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3 μm);流動相A:水,流動相B:甲醇;流速:0.80 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～3.0 min, 10%B～55%B; 3.0～6.5 min, 55%B; 6.5～9.5 min, 55%B～95%B; 9.5～9.6 min, 95%B～10%B, 9.6～13.0 min, 10%B。

1.3.2質譜條件

離子源:大氣壓化學電離源,負離子掃描模式;噴霧電壓(IS): -4 500 V;離子源溫度(TEM): 500 ℃;氣簾氣(氮氣)壓力:40 kPa;碰撞氣(氮氣)壓力:中等;霧化氣(氮氣)壓力:50 kPa;輔助加熱器壓力(氮氣): 60 kPa;放電電流:-2 μA;多反應監(jiān)測(MRM)模式。

優(yōu)化后的3種目標化合物的保留時間與質譜參數(shù)見表1。

表1 MRM模式下5NG、PNP和ONP的保留時間與質譜參數(shù)

圖1 不同提取溶劑對5NG、PNP和ONP回收率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of 5NG, PNP and ONP

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

復硝酚鈉易溶于水,可溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑。研究首先選取常用的有機試劑如甲醇、乙腈、0.1%乙酸乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑進行提取效率對比試驗,直接加入等量有機試劑提取,再濃縮上機,考察4種有機試劑對3種化合物回收率的影響,結果見圖1。采用乙酸乙酯提取的溶液不能直接用于質譜分析,需要氮吹至干轉換溶劑,但通過標準品驗證,吹干復溶操作會導致目標化合物損失嚴重,特別是鄰硝基酚鈉損失超過50%。其余3種有機提取試劑中,0.1%乙酸乙腈的提取效率最高,接近95%;乙腈次之,能達到90%。但直接加入有機溶劑容易使蛋白質和脂肪含量較高的肌肉組織結團,難以分散,需要通過高速勻漿才能使其均勻分散,增加了前處理的復雜性。而且,用乙腈和0.1%乙酸乙腈直接提取雖然效率高,但提取濃縮后基質效應很大,需要設計更多的凈化步驟去除基質效應,增加了實驗的不確定性。復合硝酚鈉中的3種組分在堿性條件下均以負離子形式存在,親水性很強,因此嘗試采取先用氫氧化鈉溶液進行提取,再用有機溶劑反萃取的兩步提取方法進行試驗。強堿不僅能夠溶解大部分的水溶性雜質,而且能夠使蛋白質變性,形成可以通過離心即能除去的沉淀,而微溶于水中的脂肪顆粒則可以通過后續(xù)用正己烷進一步除去。被提取出來的溶液通過鹽酸調節(jié)成酸性,此時,復硝酚鈉的3種組分呈現(xiàn)分子形態(tài)[20],疏水性強,易富集于有機溶劑。考慮到要在質譜儀上進行負離子檢測,且提取液吹干會造成損失,故選擇提取效率較高、能用于質譜分析的乙腈作為萃取劑進行反萃,再通過加入氯化鈉使溶液飽和,進一步降低目標化合物在水相中的殘留,使其最大化地在有機相中富集,提高萃取效率,減少基質效應。故本研究采用堿溶液作為提取溶劑再用乙腈反萃取替代直接加入有機溶劑的提取方式。

2.2 凈化方法的選擇

提取液的凈化是樣品前處理過程中關鍵的一步,直接關系到方法的定量限和回收率。動物基質成分復雜,強堿溶液作為提取溶劑能把部分水溶性雜質、蛋白質和脂肪去除。乙腈作為反萃溶劑能把微溶于水相的脂肪顆粒提取出來,故要設計凈化方式除去溶于乙腈中的少量脂肪。研究選取正己烷和幾種不同品牌的除脂柱(Oasis PRiME HLB小柱和EMR-Lipid小柱)進行脫脂試驗。結果顯示,正己烷的液液分配凈化方式即可達到脫脂效果;而使用除脂柱前,要求備用液含20%水才能使脂肪被有效吸附,但此操作卻不利于后續(xù)氮吹濃縮和定容。因此,凈化步驟采用簡單快捷的正己烷液液分配方法去除脂溶性雜質。

2.3 流動相的優(yōu)化

2.3.1流動相選擇

根據(jù)復硝酚鈉的性質,比較了甲醇、乙腈和不同濃度的甲酸銨和水溶液作為流動相時的分離效果。結果表明,當水相使用不同濃度的甲酸銨溶液時,鄰硝基酚鈉和對硝基酚鈉均未能有效分離;當水相使用一級水時,3種組分有效分離且靈敏度達到最高。當有機相選擇使用乙腈時,出現(xiàn)了基線不平的現(xiàn)象,且鄰硝基酚鈉出峰前有干擾峰無法分離。通過比較保留時間、響應值、背景干擾和洗脫能力,流動相體系最終確定為甲醇-水,不但節(jié)省了溶劑配制的時間,且峰形好,靈敏度高。

2.3.2洗脫方式的優(yōu)化

在等度洗脫實驗中,當甲醇大于55%時,復硝酚鈉的3種組分便能有效分離,單純對標準溶液進行色譜分離,重復性好,未見異常。但在實際樣品的色譜分離中發(fā)現(xiàn):甲醇比例達到55%～80%時,前一個樣品在色譜柱上分離后因等度洗脫的有機相比例不高,洗脫能力較弱,導致極性較大的雜質仍被保留在色譜柱上,干擾了下一個樣品的色譜分離。然而,當甲醇比例大于80%時,復硝酚鈉3種組分在色譜柱上均不保留,出峰時間小于2 min,容易被共流出物干擾影響定量。因此,優(yōu)化了梯度洗脫方式進行樣品的色譜分離,確保當次進樣的目標分析物和雜質均能被洗脫,不會對下一個樣品分離造成影響,且保留時間適中,能最大限度地避免雜質干擾。

2.4 離子源的選擇

研究對比了液相色譜-串聯(lián)質譜法常用的電噴霧電離和大氣壓化學電離兩種電離模式。其中,5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉和對硝基酚鈉在ESI模式下響應很高,但基質效應也很強。而鄰硝基酚鈉則因其硝基上的氧原子與鄰位酚羥基上的氫原子形成了分子內氫鍵,產生鄰位效應[21],酚羥基上的氫原子電離效率差,導致靈敏度比對硝基酚鈉低了至少3個數(shù)量級,在樣品檢測中難以適應禁用獸藥的痕量檢測要求,故容易被忽略和遺漏。APCI由于電離原理與ESI不同,離子轉化率更高,主要適用于弱極性化合物的檢測[22]。復硝酚鈉3種組分在APCI模式下分離的色譜峰見圖2,可見響應良好,均能達到痕量分析水平,且不易形成多電荷分子碎片,離子競爭少,雜峰較少,基質效應也較弱,故選擇使用APCI模式電離。

圖2 APCI模式下5NG、PNP和ONP混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of 5NG, PNP and ONP in mixed standard solutions at atmospheric pressure chemical ionization mode 5NG: 10 μg/L; PNP: 20 μg/L; ONP: 50 μg/L.

2.5 基質效應評價

動物源食品的樣品基質復雜,進行質譜分析時容易受到基質中共流出物的干擾,影響方法的靈敏度和重復性,故需要對基質效應進行評價。根據(jù)實際情況及可操作性,選擇按Matuszewski等[23]提出的提取后添加法評價基質效應。以陰性空白基質提取液作為溶劑,配制5.0 μg/L的混合標準溶液1,測定其峰面積為A;以定容液為溶劑配制5.0 μg/L的混合標準溶液2,測定其峰面積為B。ME=B/A×100%,結果見圖3。其中,ME>100%為基質增強效應,ME<100%為基質抑制效應,ME=100%可以當作基質效應不存在,這是最為理想的一種情況,但實際操作中,一般ME值在85%～115%之間,則認為基質效應不明顯[24]。

圖3 在不同基質中5NG、PNP和ONP的基質效應Fig. 3 Matrix effects of 5NG, PNP and ONP on different matrices

針對復硝酚鈉這類弱極性化合物,本實驗采用了相比ESI源離子化效率更高、基質效應較小的APCI源[25-27],由圖3可見,3種目標化合物在4種基質中的基質效應在95%～109%以內,表明優(yōu)化前處理方法后提取所得樣液對目標化合物的基質影響不大,因此無需使用基質匹配標準曲線校正,提高了方法在日常多樣化樣品中的檢測效率。

表2 5NG、PNP和ONP的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)和定量限

2.6 線性范圍與定量限

在設定的實驗條件下,配制一系列不同濃度的標準溶液,以儀器響應峰面積對復硝基酚鈉3種組分的質量濃度進行線性回歸。結果表明,5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、對硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉分別在0.5～10、1.0～20和2.5～50 μg/L范圍內的線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.999 9。當樣品中的復硝酚鈉含量超過其線性范圍時,可適當加大樣品的稀釋倍數(shù),使其上機濃度落在線性范圍內。在陰性空白樣品中從低到高添加不同水平的混合標準工作溶液,以定量離子對色譜峰的信噪比(S/N)大于10確定方法的定量限,結果見表2。

以魚肉為代表基質,添加定量限水平濃度的標準溶液時,3種目標化合物的定量離子對MRM色譜圖見圖4。

圖4 空白魚肉添加定量限水平5NG、PNP和ONP時的提取離子色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of 5NG, PNP and ONP in blank fish sample spiked at LOQ level

2.7 方法的準確度

采用空白樣品加標方法進行加標回收和精密度試驗。分別對豬肉、雞肉、魚肉和肝臟進行3個水平(定量限、2倍定量限和10倍定量限)加標,每個水平平行測定6次,計算平均回收率和相對標準偏差。結果表明,復硝酚鈉的3種組分在4種基質中的平均回收率在81.4%～102%之間,相對標準偏差在0.91%～8.85%之間(見表3),符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[28]規(guī)定的要求,可用于動物源食品中復硝酚鈉的定量檢測。

2.8 實際樣品檢測

用本方法對市售豬肉、雞肉、魚肉和肝臟樣品共96份進行測定。結果顯示,其中1個雞肉樣品檢出對硝基酚鈉,含量為27.0 μg/kg, 5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉和鄰硝基酚鈉均未檢出。其余樣品也均未檢出3種復硝酚鈉。

3 結論

本文結合動物源性基質的特點和復硝酚鈉的理化性質，對前處理方法和儀器方法進行了優(yōu)化，建立了HPLC-APCI-MS/MS法，用于同時測定動物源食品中復硝酚鈉的3種組分。該方法檢測成本低，實驗周期短，在多種基質中的加標回收率高，重復性好，定量科學準確，基質效應不明顯，能夠為動物源食品中復硝酚鈉的殘留檢測提供可靠的技術支持。