穆瑛琦, 吳奕萱, 王 逍, 胡利明, 柯潤輝*

(1. 北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部, 北京 100124; 2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司, 北京 100015; 3. 中輕檢驗認(rèn)證有限公司, 北京 100016)

有機(jī)酸是一類含有羧基的酸性化合物,存在廣泛,種類繁多,是重要的生理活性物質(zhì)[1]。同時,有機(jī)酸還有助于增加食品的感官特性和健康特性,對食品的品質(zhì)控制起到重要作用[2]。

有機(jī)酸是酒類口味的重要組成部分,賦予酒體特定的口感和味道,有機(jī)酸的缺乏或者過量都會導(dǎo)致酒的口感不協(xié)調(diào)[3]。不同的原料與釀造工藝使不同類型的酒中有機(jī)酸組成和含量有一定的差別,對酒的感官品質(zhì)有很大影響,是酒類產(chǎn)品風(fēng)味與營養(yǎng)的質(zhì)量指標(biāo)[4]。因此,有機(jī)酸的分析對酒類釀造過程的調(diào)控及成品的評定與質(zhì)量監(jiān)控都有重要意義。但是,對于復(fù)雜基質(zhì)中低含量的目標(biāo)物進(jìn)行有效分離和準(zhǔn)確測定是酒中有機(jī)酸檢測時所面臨的重大挑戰(zhàn)[5]。

常用的有機(jī)酸檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法(IC)等[6-10]。液相色譜法中部分有機(jī)酸會出現(xiàn)共洗脫現(xiàn)象[11],分離效果較差;液相色譜法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在測小分子有機(jī)酸時均需要用極性大、pH低的洗脫液,對色譜柱破壞較大,不宜批量檢測[12];氣相色譜法適用于相對分子質(zhì)量較低揮發(fā)性有機(jī)酸的檢測,對于相對分子質(zhì)量較高的有機(jī)酸則需要進(jìn)行衍生化處理,操作煩冗,重復(fù)性較差,質(zhì)量控制相對較難[13];毛細(xì)管電泳法檢測速度快、實驗成本低,適用于有機(jī)酸的快速分析,但相比于色譜法,其精密度和靈敏度較差[14]。相對來說,離子色譜法是分析有機(jī)酸的一種有效方法,具有操作簡便、分離良好、靈敏度高等優(yōu)點[15],但其局限性在于目標(biāo)物的定性只能依靠保留時間,且易受其他共存離子的干擾[16,17]。三重四極桿質(zhì)譜憑借抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、選擇性好、適用范圍廣等優(yōu)勢,已成為痕量物質(zhì)定性確證和定量分析的首選方法[18]。通過聯(lián)用,離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(IC-MS/MS)將離子色譜與三重四極桿質(zhì)譜的優(yōu)點相結(jié)合,既提高了極性物質(zhì)的分離能力,又提高了在復(fù)雜基質(zhì)中對極性物質(zhì)檢測的選擇性與靈敏度,與此同時還能夠提供物質(zhì)的相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息。應(yīng)用IC-MS/MS來分析酒中有機(jī)酸,不僅可以實現(xiàn)多種有機(jī)酸的同時測定,而且可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證,提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。目前,采用固相萃取法對酒中有機(jī)酸進(jìn)行樣品前處理,并結(jié)合IC-MS/MS對有機(jī)酸進(jìn)行分析的研究鮮有報道。

本研究通過設(shè)計新型的連接流路,解決了離子色譜與質(zhì)譜相連接時所面臨的流速不兼容及緩沖鹽污染質(zhì)譜的難題,搭建了離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)的分析裝置,以酒類樣品中有機(jī)酸為切入點,探索離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在極性物質(zhì)檢測中應(yīng)用的有效性和實用性。同時,對樣品前處理技術(shù)、色譜分離條件、質(zhì)譜檢測參數(shù)等做了探討研究,建立了一種高效、準(zhǔn)確、綠色測定酒類樣品中有機(jī)酸的方法,極大地降低了基體干擾,提高了分析方法的信噪比和靈敏度,為酒類品質(zhì)管理和質(zhì)量評價提供了強(qiáng)有力的方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex ICS3000型離子色譜儀(美國Dionex公司); ACQUITY TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司); Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)、Dionex IonPacTMAS11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm)、Dionex ADRS 600 (4 mm)陰離子抑制器(美國Thermo公司); Milli-Q純水儀(美國Millipore公司);渦旋混合器(德國IKA公司);氮吹儀(北京帥恩科技有限公司)。

草酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、奎尼酸、烏頭酸和乳酸(純度>98%,壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司); IC-RP固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取柱均購自博納艾杰爾科技公司;Poly-sery固相萃取柱(德國CNW公司); 0.22 μm水相濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

樣品:清香型、濃香型、醬香型白酒,以及黃酒、干紅葡萄酒均購自市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于5 mL容量瓶中,用超純水進(jìn)行溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃下避光保存。用超純水稀釋并配制成為不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃下冰箱冷藏保存。使用時用超純水逐級稀釋,配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理方法

白酒:取白酒樣品5 mL于15 mL離心管中,氮吹至1 mL后用4 mL超純水復(fù)溶至5 mL,吸取復(fù)溶液1 mL稀釋100倍,將復(fù)溶液及稀釋后的溶液通過0.22 μm濾膜,收集濾液上機(jī)分析。

黃酒及干紅葡萄酒樣品:取黃酒及干紅葡萄酒樣品各10 mL于15 mL離心管中,在8 000 r/min條件下離心10 min,將上清液移入新的離心管中待用。分別用10 mL甲醇、10 mL水活化石墨化炭黑固相萃取小柱,將黃酒及干紅葡萄酒樣品分別通過石墨化炭黑固相萃取小柱進(jìn)行凈化,棄去前3 mL流出液,收集后段流出液。將黃酒流出液用去離子水稀釋50和200倍,將葡萄酒流出液用去離子水稀釋100和400倍,通過0.22 μm濾膜,收集濾液上機(jī)分析。

1.4 檢測條件

1.4.1色譜條件

色譜柱采用Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm), Dionex IonPacTMAS11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm),柱溫30 ℃,檢測池溫度35 ℃,流速1.0 mL/min。流動相為由淋洗液自動發(fā)生器在線產(chǎn)生的KOH溶液。梯度洗脫程序為:0～15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0～25.0 min, 0.8～50.0 mmol/L KOH; 25.0～30.0 min, 50.0～70.0 mmol/L KOH; 30.0～35.0 min, 70.0 mmol/L KOH; 35.0～35.1 min, 70.0～0.8 mmol/L; 35.1～38.0 min, 0.8 mmol/L KOH。進(jìn)樣量25 μL; Dionex ADRS 600 (4 mm)型陰離子抑制器,抑制電流175 mA。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:負(fù)離子模式掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓為3.10 kV;離子源溫度為120 ℃；錐孔氣流速為50 L/h;錐體電壓50 V;霧化氣體流量7.0 L/h;碰撞氣體流量0.15 mL/min;碰撞池出口電位5 V;脫溶劑氣溫度為400 ℃,流速為850 L/h;采用MRM模式采集各標(biāo)準(zhǔn)樣品的母離子及對應(yīng)的響應(yīng)較強(qiáng)的子離子,使用分析軟件(MassLynx, 4.1版)進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理,10種有機(jī)酸的保留時間、母離子、子離子及錐孔電壓(cone voltage)和碰撞能量(collision energy)等參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

白酒屬于蒸餾酒,雜質(zhì)較少。但實驗發(fā)現(xiàn),若白酒稀釋后直接進(jìn)樣,由于乙醇的存在會對乳酸的峰形造成干擾,使得乳酸的離子峰變寬,無法準(zhǔn)確定量。本實驗利用氮吹儀將白酒樣品中的大量乙醇揮發(fā)去除[19],再用去離子水進(jìn)行稀釋,進(jìn)樣檢測。通過實驗驗證,10種有機(jī)酸回收率為88.3%～111.5%,回收率良好。

黃酒和干紅葡萄酒相比于白酒組分較為復(fù)雜，黃酒中焦糖色色素為主要干擾物質(zhì)；干紅葡萄酒中色素、多酚類物質(zhì)以及糖等都有可能對有機(jī)酸的檢測產(chǎn)生干擾[20]。

為了提高有機(jī)酸的回收率，本實驗首先對比了不同固相萃取柱對于干紅葡萄酒的凈化效果，選擇了Poly-sery去除食品中著色劑專用SPE柱、IC-RP固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取小柱進(jìn)行測定。發(fā)現(xiàn)采用Poly-sery柱以及IC-RP柱時，10種有機(jī)酸的回收率均較低，部分有機(jī)酸回收率低于70%(見圖1)，凈化效果較差。石墨化炭黑柱對10種有機(jī)酸的回收率均良好，故選用石墨化炭黑固相萃取柱進(jìn)行凈化。隨后，使用石墨化炭黑固相萃取柱對黃酒進(jìn)行凈化，結(jié)果表明，10種有機(jī)酸回收率為89.5%～107.2%，回收率較好。為實驗方法統(tǒng)一，故選擇石墨化炭黑固相萃取柱對黃酒及干紅葡萄酒進(jìn)行凈化。

表1 10種有機(jī)酸的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

圖1 3種固相萃取柱對干紅葡萄酒中10種有機(jī)酸回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effects of the three SPE columns on the recoveries of the 10 organic acids in dry red wine (n=6)

2.2 離子色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

有機(jī)酸類物質(zhì)屬于極性物質(zhì),在反相C18色譜柱上保留較差,而Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)和Dionex IonPacTMAS19型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)都屬于高柱容量色譜柱,具有較強(qiáng)的親水性,對于有機(jī)酸這類極性物質(zhì)具有良好的保留特性。AS11-HC色譜柱的固定相填料主要為高交聯(lián)度的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物(EVB-DVB)聚合物,AS19色譜柱的固定相填料主要為超孔型EVB-DVB顆粒,它們本身帶有正電荷，對淋洗液中陰離子和樣品陰離子的靜電吸附作用不同。本文對比了AS11-HC和AS19色譜柱對于10種有機(jī)酸的分離情況,發(fā)現(xiàn)在使用AS11-HC色譜柱時,10種有機(jī)酸的分離效果更好,最終選擇Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)進(jìn)行分離。

2.2.2梯度洗脫程序的優(yōu)化

有機(jī)酸類化合物具有酸性和親水性,在較強(qiáng)的堿性溶液中以陰離子形式存在。離子色譜中的淋洗液發(fā)生器可以在線產(chǎn)生不同濃度的KOH溶液,消除人工配制淋洗液所帶來的誤差和可能的空氣污染,保障了淋洗液的高純度及穩(wěn)定性,增強(qiáng)了系統(tǒng)的重現(xiàn)性和靈敏度[21]。因此,本文選擇淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的KOH溶液作為淋洗液。

對于小分子有機(jī)酸,電荷數(shù)是影響其柱保留的主要因素。本實驗中分離的有機(jī)酸包括一元、二元和三元羧酸,在水或稀堿液中會解離成一價、二價和三價陰離子,不同價態(tài)離子與離子交換劑親和力不同,電荷越高,親和力越大。因此,為了改善分離效果,達(dá)到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的,本文考察不同濃度的KOH淋洗液對標(biāo)準(zhǔn)樣品分析的影響,并進(jìn)行梯度洗脫程序優(yōu)化實驗?？崴岷腿樗崾且粌r無機(jī)陰離子,對離子交換劑的親和力較弱,出峰時間較早,所以前15 min需要用低濃度(小于5 mmol/L)的KOH進(jìn)行洗脫。故本實驗前15 min選取了0.8、1.5、3.0 mmol/L的KOH對奎尼酸和乳酸的分離效果進(jìn)行考察(見圖2), 15 min后的淋洗液梯度統(tǒng)一為40～60 mmol/L KOH梯度洗脫?？梢钥吹角?5 min隨著淋洗液濃度的增加,奎尼酸和乳酸的分離時間不斷提前,分離度不斷減小。結(jié)果表明,當(dāng)初始淋洗液濃度為0.8 mmol/L KOH時兩種酸的分離效果最好。

圖2 采用不同初始濃度淋洗液時10種有機(jī)酸的總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the 10 organic acids with different concentrations of initial elutions

草酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸和烏頭酸是二價無機(jī)陰離子,檸檬酸為三價無機(jī)陰離子,對離子交換劑的親和力較強(qiáng),出峰時間較晚,所以20 min后需要用較高濃度的KOH進(jìn)行洗脫。故考察15 min后不同梯度程序?qū)?種酸的分離影響(見圖3)。結(jié)果表明,隨著淋洗液濃度的增加,8種有機(jī)酸的出峰時間均提前,分離效果相近。當(dāng)選用圖3a的梯度程序時,10種有機(jī)酸的整體出峰時間為38 min,而選用圖3c的梯度程序時,整體出峰時間為32 min,為了實現(xiàn)快速分離檢測,故選擇圖3c的梯度程序進(jìn)行洗脫分離。

圖3 采用不同淋洗液梯度時10種有機(jī)酸的總離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of the 10 organic acids with different gradient elutions a. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-30.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 30.0-50.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 50.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 50.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH. b. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-40.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 40.0-60.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 60.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 60.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH. c. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-50.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 50.0-70.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 70.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 70.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH.

2.2.3流速的選擇

在確定了分析柱和淋洗液的情況下,對流速進(jìn)行了優(yōu)化。分別考察了流速0.8、1.0、1.2 mL/min對分離效果的影響。實驗結(jié)果表明,流速越高,分析時間越短,但分離度會受到一定影響。當(dāng)流速為1.2 mL/min時,出峰時間較為靠前,但柱壓接近2.0×107Pa上限,長時間高壓檢測,對色譜柱及儀器的使用壽命有較大影響[22]。當(dāng)流速為0.8 mL/min時,發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形較寬。綜合測定時間、響應(yīng)值、色譜柱使用壽命以及峰形,最終確定流速為1.0 mL/min。

2.3 離子色譜與質(zhì)譜連接方式的優(yōu)化

離子色譜淋洗液中含有KOH,當(dāng)其進(jìn)入到ESI源時無法完全揮發(fā),進(jìn)而堆積在電噴霧噴嘴處,對儀器部件產(chǎn)生腐蝕,對儀器的損傷較大。在測定時需要避免難揮發(fā)緩沖鹽進(jìn)入質(zhì)譜檢測器。離子色譜中的電解抑制器可以實現(xiàn)在線除鹽,消除淋洗液中的鹽或堿對ESI源的影響和對質(zhì)譜部件的損害。通過選擇ADRS 600 (4 mm)型抑制器,調(diào)節(jié)抑制器的電流,使抑制器電解水產(chǎn)生H+,通過陽離子交換膜使K+與H+進(jìn)行交換然后排至廢液。最終進(jìn)入質(zhì)譜的為經(jīng)過抑制器抑制后的產(chǎn)物純水[23]。

本實驗選擇使用AS11-HC型號色譜柱進(jìn)行分離待測物,最佳流速為1.0 mL/min,而質(zhì)譜的最適流速為0.3～0.5 mL/min,若以1.0 mL/min的流速直接進(jìn)入質(zhì)譜檢測器會使溶劑揮發(fā)不完全,而未霧化的液滴還有可能進(jìn)入質(zhì)譜,污染質(zhì)譜內(nèi)部,使背景噪聲增大,影響檢測。所以本實驗在進(jìn)入質(zhì)譜檢測器前安裝了一個三通進(jìn)行分流,使進(jìn)入質(zhì)譜的流速保持在0.5 mL/min,將分流出的一部分淋洗液回流至抑制器中進(jìn)行再生。在保證被測物質(zhì)良好分離的情況下,降低背景噪聲,同時以適于質(zhì)譜檢測的流速進(jìn)入質(zhì)譜,得到良好的檢測結(jié)果。儀器連接方式見圖4。

圖4 儀器連接示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the instrument connection

表2 10種有機(jī)酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

本實驗選擇三重四極桿質(zhì)譜作為檢測器測定樣品的含量,其抗干擾能力強(qiáng),靈敏度高,能準(zhǔn)確進(jìn)行定性和定量。采用注射泵以流動注射的方式分別在正離子和負(fù)離子模式下對1 mg/L的10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,結(jié)果表明:有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較好。錐孔電壓和碰撞能量是影響質(zhì)譜測定結(jié)果的重要因素,錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度,過高的錐孔電壓會導(dǎo)致分子離子在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞解離,從而影響母離子的豐度,進(jìn)而影響檢出限和靈敏度。通過全掃描逐個進(jìn)行前體離子掃描,根據(jù)離子信號強(qiáng)度選出目標(biāo)前體離子,母離子為[M-H]-型,利用儀器手動優(yōu)化功能,分別對錐孔電壓和碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化,同時考察霧化氣溫度,毛細(xì)管溫度等指標(biāo),確定測定的最佳質(zhì)譜條件。10種有機(jī)酸的MRM色譜圖見圖5。

圖5 10種有機(jī)酸的MRM色譜圖Fig. 5 Chromatograms of the 10 organic acids in MRM mode

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1線性范圍和檢出限

將10種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。按前文1.4.1和1.4.2節(jié)中所述的離子色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定。以10種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,見表2?？梢园l(fā)現(xiàn),10種有機(jī)酸在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。以色譜峰信噪比S/N=3和S/N=10的濃度分別確定方法的檢出限(LOD)以及定量限(LOQ), 10種有機(jī)酸的檢出限在1.0～8.0 μg/L之間,定量限在3.5～26.5 μg/L之間。

2.5.2精密度和回收率

將低、中、高3個水平的適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到3種酒類樣品中,進(jìn)行加標(biāo)回收測定,每個加標(biāo)水平測定6次,回收率和精密度結(jié)果如表3所示。白酒、黃酒和干紅葡萄酒樣品中10種有機(jī)酸在低、中、高3個加標(biāo)水平下均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。平均加標(biāo)回收率為83.0%～112.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤ 9.1%,可用于3種酒樣品中10種有機(jī)酸含量的測定。

表3 10種有機(jī)酸在不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 實際樣品的檢測

采用所建立的方法對市場上購買的白酒(清香型、濃香型和醬香型)、黃酒、干紅葡萄酒進(jìn)行測定(見表4),經(jīng)過不同稀釋倍數(shù)換算后,得到3種酒類樣品中10種有機(jī)酸的測定值。結(jié)果表明，白酒中,醬香型白酒含有的有機(jī)酸種類較多,所以醬香型白酒相對于其他兩種香型白酒口感更為豐富[24], 3種香型的白酒中,乳酸含量均為最高,其中醬香型白酒中乳酸含量最高。黃酒與干紅葡萄酒中均含有8種有機(jī)酸,其中黃酒中乳酸及琥珀酸含量較高,干紅葡萄酒中乳酸、琥珀酸及酒石酸含量較高。

3 結(jié)論

本文搭建了離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測平臺,并建立了一種固相萃取結(jié)合離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定白酒、黃酒、干紅葡萄酒3種酒類樣品中10種有機(jī)酸的檢測方法。采用陰離子分析柱解決了常規(guī)方法中極性物質(zhì)不易保留的難題;采用質(zhì)譜對有機(jī)酸進(jìn)行定性與定量,與常規(guī)方法相比,提高了抗干擾能力與靈敏度,同時避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。對實際樣品的檢測表明,該方法能夠滿足3種酒樣品中10種有機(jī)酸的分析要求,為不同酒品中有機(jī)酸的定性和定量分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與技術(shù)支持。