陸紹銘, 徐 鑫,3, 薛倩倩, 肖柳君, 余文怡,, 魏 彤, 金紅利,3,*, 劉艷芳,3,, 梁鑫淼,3,

(1. 贛江中藥創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330000; 2. 江西省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330000;3. 中科院大化所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院, 江蘇 泰州 225300; 4. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

復(fù)方金錢草顆粒是由廣金錢草(GJQC)、車前草(CQC)、光石韋(GSW)、玉米須(YMX)4味中藥材為主要原料加工制成的中藥制劑,有清熱利濕、通淋排石的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,復(fù)方金錢草顆粒具有利尿、抑制泌尿系結(jié)石形成、抗炎、抗氧化作用,能有效抑制結(jié)晶腎損傷,在治療泌尿系結(jié)石、尿路感染等癥時(shí)有顯著功效[2,3]。復(fù)方金錢草顆粒已被列入2021年國家基本醫(yī)療保險(xiǎn)用藥目錄。復(fù)方金錢草顆粒中含有黃酮類、多糖類、氨基酸類、揮發(fā)油類等多種有效成分[4-7],但現(xiàn)行《中國藥典》(2020版)僅對光石韋中的芒果苷進(jìn)行了含量測定[1]。不同于化學(xué)藥品成分的單一性,中藥復(fù)方制劑具有多成分和多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。使用單一指標(biāo)成分的定性、定量分析方法并不能全面反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量[8]。因此,建立一種整體、全面的復(fù)方金錢草顆粒質(zhì)量控制方法具有重要意義。本課題組2008年首次提出基于定量指紋圖譜技術(shù)的中藥質(zhì)量控制策略,在原有指紋圖譜的方法上賦予其大量的定性、定量信息,并將這些信息共同應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制;通過對指紋圖譜中的多個(gè)目標(biāo)成分尤其是有效成分的準(zhǔn)確定量描述可使中藥質(zhì)量控制更加準(zhǔn)確,更能真實(shí)地反應(yīng)中藥的質(zhì)量狀況[9,10],在中藥質(zhì)量控制方面有廣泛的應(yīng)用[11,12]?；瘜W(xué)模式識(shí)別技術(shù)是一種根據(jù)物質(zhì)所含化學(xué)成分信息,借助計(jì)算機(jī)處理以揭示事物內(nèi)部規(guī)律的綜合技術(shù)[13],利用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)將指紋圖譜中的有效信息進(jìn)行綜合、降維和分類分析,可以更加準(zhǔn)確、全面、科學(xué)地對中藥材進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

本研究建立了復(fù)方金錢草顆粒的超高效液相色譜-紫外檢測(UPLC-UV)定量指紋圖譜,并利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)對指紋圖譜共有峰進(jìn)行解析,結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對不同年份的復(fù)方金錢草顆粒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),為復(fù)方金錢草顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity I Class超高效液相色譜系統(tǒng),包括四元泵、PDA檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower色譜工作站(Waters,美國); Agilent Infinity Ⅱ 1290-6545超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent,美國); KQ-500 DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); XSE105型十萬分之一分析天平、ML204T/02型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司); Sorvall ST8型高速離心機(jī)(賽默飛世爾蘇州儀器有限公司)。

色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲酸、質(zhì)譜級(jí)乙腈購自Fisher公司;超純水由Milli-Q純水機(jī)制備,其余試劑均為分析純。對照品芒果苷(批號(hào)111607-201704,純度98.1%)、毛蕊花糖苷(批號(hào)111909-201906,純度98.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院;異芒果苷(批號(hào)PS010037,純度98.0%)、維采寧-3(批號(hào)PS020541,純度98.0%)、異牡荊苷(批號(hào)PS001063,純度≥98.0%)、異葒草素(批號(hào)PS001039,純度>98.0%)、夏佛塔苷(批號(hào)PS010457,純度>98.0%)、維采寧-2(批號(hào)PS012054,純度>98.0%)均購自成都普思生物科技有限公司。2種規(guī)格的復(fù)方金錢草顆粒樣品共36批,規(guī)格(1)為10 g/袋,規(guī)格(2)為3 g/袋,均購自廣西萬通制藥有限公司,具體信息見表1。

表1 36批復(fù)方金錢草顆粒樣品信息

1.2 對照品溶液的制備

取芒果苷、異芒果苷對照品適量,加50%甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度分別為83.267 3 mg/L和65.385 6 mg/L的混合對照品溶液;取毛蕊花糖苷、維采寧-3、異牡荊苷、異葒草素、夏佛塔苷及維采寧-2對照品適量,加50%甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度分別為396、200、290、258、344及216 mg/L的混合對照品溶液。

1.3 供試品溶液的制備

取10袋樣品,混勻,取適量,研細(xì)后取約2 g規(guī)格(1)樣品或0.6 g規(guī)格(2)樣品,精密稱定后移至具塞錐形瓶中;加入25 mL 50%甲醇水溶液,密塞,稱重,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)10 min;將樣品取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇水溶液補(bǔ)足損失的質(zhì)量,搖勻后離心(10 000 r/min)10 min,取上清液過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

圖1 35批復(fù)方金錢草顆粒的UPLC指紋圖譜Fig. 1 Ultra performance liquid chromatography (UPLC) fingerprints for the 35 batches of Fufang Jinqiancao granules

1.4 儀器條件

1.4.1UPLC條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 流動(dòng)相:A相為乙腈,B相為0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫。梯度洗脫條件:0～5 min, 9%A; 5～10 min, 9%A～12%A; 10～18 min, 12%A～20%A。檢測波長:350 nm;體積流量:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫:35 ℃。

1.4.2LC-MS/MS條件

LC-MS/MS的色譜條件同1.4.1節(jié);離子源:電噴霧雙噴離子源(Dual AJS ESI);掃描模式:一級(jí)質(zhì)譜采集(MS),自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜采集(auto MS/MS);正、負(fù)離子掃描模式;采集范圍:MSm/z100～1 000, MS/MSm/z50～1 000;氣簾氣溫度:320 ℃;鞘氣溫度:320 ℃;干燥氣流速:8 L/min;離子化電壓:+3 500 V和-3 000 V;毛細(xì)管出口電壓:135 V;碰撞能量:20 eV和40 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜的建立

取35批復(fù)方金錢草顆粒樣品(S1～S35),分別按照1.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,每批樣品平行制備2份供試品溶液,按照1.4.1節(jié)中的方法依次進(jìn)樣檢測,獲得復(fù)方金錢草顆粒的UPLC指紋圖譜(見圖1)。將統(tǒng)一積分后的數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜特征圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012版),以S1批樣品的圖譜為參照,時(shí)間窗口設(shè)置為0.1,使用平均數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配,加以多點(diǎn)校正,確定12個(gè)共有色譜峰,建立了復(fù)方金錢草顆粒的UPLC對照指紋圖譜(見圖2)。

圖2 復(fù)方金錢草顆粒的UPLC對照指紋圖譜Fig. 2 UPLC reference fingerprints of Fufang Jinqiancao granules 1. mangiferin; 2. isomangiferin; 3. vicenin-2; 4. vicenin 3 isomer, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-apioside; 5. isoorientin; 6. orientin; 7. schaftoside; 8. vicenin 3 isomer; 9. vicenin 3; 10. isovitexin; 11. acteoside; 12. plantamajoside.

采用1.4.2節(jié)中的質(zhì)譜條件進(jìn)行定性分析,通過分析化合物的保留時(shí)間、一級(jí)離子質(zhì)荷比以及二級(jí)碎片離子信息,結(jié)合文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫及對照品比對,在復(fù)方金錢草顆粒對照指紋圖譜中共指認(rèn)出12個(gè)特征峰,主要為黃酮類和苯丙素類化合物。其中芒果苷、異芒果苷為光石韋中的專屬成分,維采寧-2、夏佛塔苷、維采寧-3、維采寧-3的異構(gòu)體為廣金錢草中的專屬成分,異牡荊苷為玉米須的專屬成分,毛蕊花糖苷、大車前苷為車前草的專屬成分(見表2),該結(jié)果為進(jìn)一步研究復(fù)方金錢草顆粒的化學(xué)成分組成及闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考依據(jù)。

表2 復(fù)方金錢草顆粒指紋圖譜特征峰的鑒定

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn) 取復(fù)方金錢草顆粒樣品S36,按照1.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次;按照1.4.1節(jié)條件進(jìn)行測定,以2號(hào)峰異芒果苷為參照峰,計(jì)算共有峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0.02%～0.13%,相對峰面積RSD值為0.25%～1.08%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方金錢草顆粒樣品S36,按照1.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀;按照1.4.1節(jié)條件進(jìn)行測定,以2號(hào)峰異芒果苷為參照峰,計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間RSD值為0.02%～0.08%,相對峰面積RSD值為0.24%～2.26%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方金錢草顆粒樣品S36,精密稱定6份,按照1.3節(jié)中的方法平行制備6份供試品溶液;按照1.4.1節(jié)條件進(jìn)行測定,以2號(hào)峰異芒果苷為參照峰,計(jì)算共有峰相對保留時(shí)間的RSD值為0.02%～0.11%,相對峰面積的RSD值為0.51%～1.29%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.3 指紋圖譜評價(jià)

2.3.1相似度評價(jià)

將得到的35批復(fù)方金錢草顆粒指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版),進(jìn)行色譜峰匹配,計(jì)算不同批次樣品與對照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示樣品的相似度均≥0.952,表明35批樣品的指紋圖譜相似度較高,不同批次樣品的質(zhì)量相對穩(wěn)定。

表3 35批復(fù)方金錢草顆粒樣品的相似度

2.3.2聚類分析(HCA)

分別將35批復(fù)方金錢草顆粒樣品的12個(gè)共有峰進(jìn)行峰面積歸一化計(jì)算,將歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro軟件中進(jìn)行層次聚類分析,聚類圖見圖3。結(jié)果顯示35批樣品可以分為2類,第1類為S1～S19,第2類為S20～S35,即2018年與2019年的樣品聚為一類,2020年與2021年的樣品聚為一類,表明HCA能明顯區(qū)分2018年、2019年與2020年、2021年生產(chǎn)的樣品。

圖3 35批復(fù)方金錢草顆粒的聚類分析Fig. 3 Hierarchical cluster analysis (HCA) result for the 35 batches of Fufang Jinqiancao granules

圖4 復(fù)方金錢草樣品PCA分析得分圖Fig. 4 Principal component analysis (PCA) scores of Fufang Jinqiancao granules

2.3.3主成分分析(PCA)

將35批復(fù)方金錢草顆粒樣品歸一化峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件中,進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析[21], PCA得分見圖4。從圖4中可以看到,PCA結(jié)果與HCA結(jié)果一致,即2018年、2019年的樣品與2020年、2021年的樣品有明顯的分類趨勢。但由于數(shù)據(jù)點(diǎn)較為零散,考慮進(jìn)一步采用有監(jiān)督的模型進(jìn)行分析。

2.3.4正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

為了更好地分析2018年、2019年與2020年、2021年樣品的組間差異,在PCA分組的基礎(chǔ)上,進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析,獲得相應(yīng)模型。在該模型下R2X值為0.922、R2Y值為0.563、Q2值為0.518,三者均大于0.5,表明該模型具有較好的預(yù)測能力;進(jìn)一步采用200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)驗(yàn)證模型是否存在過擬合現(xiàn)象。結(jié)果如圖5所示,所有通過隨機(jī)排序計(jì)算得到的R2和Q2值均小于原始值,且Q2回歸直線與Y軸間存在負(fù)截距,說明該模型是有效的且不存在過度擬合現(xiàn)象[22],可用于復(fù)方金錢草顆粒差異標(biāo)志物的篩選。OPLS-DA結(jié)果顯示,35批樣品被分為2類,如圖6所示,2018年、2019年的樣品聚為一類,但樣品點(diǎn)分布較為分散,表明2018年、2019年生產(chǎn)的樣品質(zhì)量差異較大;而2020年、2021年的樣品聚為一類,樣品點(diǎn)分布集中,表明2020年、2021年生產(chǎn)的樣品中組內(nèi)質(zhì)量更均一穩(wěn)定。結(jié)果表明OPLS-DA可對2018年、2019年與2020年、2021年生產(chǎn)的樣品進(jìn)行很好的聚類區(qū)分。

表4 芒果苷和異芒果苷的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及截距誤差

圖5 OPLS-DA模型的200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)Fig. 5 200 response permutation tests for orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) model

圖6 35批復(fù)方金錢草顆粒的OPLS-DA圖Fig. 6 OPLS-DA diagram of the 35 batches of Fufang Jinqiancao granules

為進(jìn)一步篩選出導(dǎo)致2018年、2019年與2020年、2021年樣品產(chǎn)生差異的成分,根據(jù)模型中變量投影重要度排序(VIP)預(yù)測值篩選出VIP值大于1的色譜峰為差異標(biāo)志物。如圖7所示,芒果苷、異芒果苷的VIP值均大于1,說明芒果苷和異芒果苷可能是區(qū)分2018年、2019年與2020年、2021年復(fù)方金錢草顆粒樣品的差異性質(zhì)量標(biāo)志物。

圖7 復(fù)方金錢草顆粒的OPLS-DA的VIP值Fig. 7 Variable importance in the projection (VIP) plot of OPLS-DA for Fufang Jinqiancao granulesFor Nos. 3-12, see Fig. 2.

2.4 芒果苷和異芒果苷含量測定

文獻(xiàn)研究表明芒果苷和異芒果苷均具有抗炎、免疫、抗菌等作用[23,24],二者與復(fù)方金錢草顆粒的藥理功效密切相關(guān),且通過化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)篩選出了兩個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物,即芒果苷和異芒果苷,故對二者進(jìn)行含量測定。

2.4.1線性關(guān)系考察

取芒果苷、異芒果苷對照品適量,加50%甲醇水溶液配制成7個(gè)質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液,其中芒果苷的質(zhì)量濃度為133.227 6、106.582 1、79.936 6、53.291 1、26.645 5、13.322 8、5.329 1 mg/L;異芒果苷的質(zhì)量濃度為104.617 0、83.693 6、62.770 2、41.846 8、20.923 4、10.461 7、4.184 7 mg/L。分別精密吸取1 μL對照品溶液,按1.4.1節(jié)條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和線性范圍,結(jié)果見表4。芒果苷和異芒果苷在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,計(jì)算回歸方程的截距誤差,結(jié)果均小于2%,表明線性關(guān)系準(zhǔn)確可靠。

2.4.2精密度試驗(yàn)

精密吸取復(fù)方金錢草顆粒供試品(S36)溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄芒果苷和異芒果苷的色譜峰面積,計(jì)算芒果苷和異芒果苷含量的RSD值分別為0.64%和0.14%,表明儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方金錢草顆粒樣品(S36),按1.3節(jié)中的方法制備6份供試品溶液,按1.4.1節(jié)條件進(jìn)樣測定，記錄芒果苷和異芒果苷的色譜峰面積,計(jì)算芒果苷和異芒果苷含量的RSD值分別為0.52%和0.28%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取復(fù)方金錢草顆粒供試品(S36)溶液,按1.4.1節(jié)條件分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄芒果苷和異芒果苷的色譜峰面積,計(jì)算芒果苷和異芒果苷含量的RSD值分別為0.71%和0.12%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已測定的同一批次復(fù)方金錢草顆粒(S36)適量,按其中芒果苷、異芒果苷含量約50%、100%、150%濃度水平準(zhǔn)確加入已知量的2種對照品混合溶液,按1.3節(jié)中的方法制成低、中、高濃度各3份的供試品溶液,記錄芒果苷和異芒果苷的色譜峰面積,計(jì)算芒果苷和異芒果苷的平均加標(biāo)回收率分別為101.7%～105.6%和103.4%～105.5%,均在《中國藥典》(2020版)規(guī)定的限度范圍(90%～108%)內(nèi)[25],RSD值分別為0.63%～1.43%和0.60%～1.18%,表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.4.6檢出限和定量限

取1.2節(jié)中芒果苷和異芒果苷的混合對照品溶液,分別加50%甲醇水溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,按1.4.1節(jié)條件進(jìn)行測定,以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限,10倍信噪比(S/N=10)確定定量限[25]。結(jié)果顯示芒果苷的檢出限為0.266 7 mg/L,定量限為0.888 9 mg/L;異芒果苷的檢出限為0.339 4 mg/L,定量限為1.131 0 mg/L。

2.4.7樣品含量測定

將35批復(fù)方金錢草顆粒按1.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.4.1節(jié)條件進(jìn)行測定,計(jì)算樣品中芒果苷和異芒果苷的含量,35批樣品中芒果苷和異芒果苷含量的累積加和圖見圖8。

圖8 35批復(fù)方金錢草顆粒指標(biāo)成分累積加和圖Fig. 8 Cumulative summation graph of contents of the 35 batches of Fufang Jinqiancao granules

由圖8可直觀看出,不同批次樣品中的成分含量存在一定差異,2020年、2021年的樣品較2018年、2019年的樣品含量更高;計(jì)算2018年、2019年樣品含量的波動(dòng)范圍,芒果苷為55%～192%,異芒果苷為68%～149%;而計(jì)算2020年、2021年樣品含量的波動(dòng)范圍,芒果苷為81%～123%,異芒果苷為87%～119%。上述結(jié)果顯示2020年、2021年與2018年、2019年的樣品相比,芒果苷與異芒果苷含量更高且波動(dòng)范圍更小,表明2020年、2021年的樣品質(zhì)量較好且相對穩(wěn)定。為保證復(fù)方金錢草顆粒的質(zhì)量,在今后的藥品生產(chǎn)中也應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這兩個(gè)成分的含量變化。

3 結(jié)論

本文首先建立了一種復(fù)方金錢草顆粒的UPLC-UV指紋圖譜,指認(rèn)了其中12個(gè)共有峰,并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)篩選出了兩個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物芒果苷和異芒果苷,并對二者進(jìn)行了含量測定。結(jié)果表明,該方法可對復(fù)方金錢草顆粒實(shí)現(xiàn)快速的定性定量分析,利用指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別,再結(jié)合含量測定可對不同年份的復(fù)方金錢草顆粒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),從而有效、準(zhǔn)確地對復(fù)方金錢草顆粒進(jìn)行全面的綜合評價(jià),為復(fù)方金錢草顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)的方法與依據(jù)。