王哲，王升厚，李夢雪，柳葉飛，王澤，徐方旭*

1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（沈陽 110034）；2.沈陽師范大學(xué)實驗教學(xué)中心（沈陽 110034）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草，2009年被批準(zhǔn)為新資源食品[1-4]。蛹蟲草富含多種生物活性成分，如蟲草素、噴司他丁、腺苷、蟲草酸、蟲草多糖、超氧化物歧化酶、麥角甾醇及黃酮類物質(zhì)等[5-9]，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗菌及抗氧化等藥理作用[10-12]。蛹蟲草通過人工培育實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，但在產(chǎn)業(yè)發(fā)展中仍存在亟待解決的技術(shù)性瓶頸問題，其中之一就是蛹蟲草在生長后期常出現(xiàn)“白毛病”，即學(xué)術(shù)界統(tǒng)稱的因感染“吃草菌”引起的真菌性病害，這種寄生性病原真菌會導(dǎo)致蛹蟲草產(chǎn)量嚴(yán)重下降[13-16]。

植物生長調(diào)節(jié)劑是一類與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，其主要成分有水楊酸、茉莉酸、多效唑和多胺。由于植物生長調(diào)節(jié)劑大多取自植物本身產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，具有微量、高效、低毒等作用，同時還可調(diào)節(jié)作物的生長發(fā)育、提高生物轉(zhuǎn)化率、改善品質(zhì)外，在作物抗病中具有顯著功效[17-20]。有研究表明，細(xì)胞壁是植物防御病原物侵染的第一道屏障。當(dāng)病原物物侵染植物后，引起細(xì)胞壁的防御反應(yīng)，參與細(xì)胞生命活動的某些信息傳遞，并發(fā)生防御反應(yīng)，細(xì)胞壁在植物抗病過程中起著重要的能動作用[21-22]。除了細(xì)胞壁能夠抵御病原菌的侵染外，近年來，更多研究表明，一些抗病蛋白需要轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)才能啟動免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗病防御作用，而細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體是實現(xiàn)這些抗病蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)運必不可少的“載體”。因此，細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運及轉(zhuǎn)運受體在抗病防御中發(fā)揮重要作用[23]。何茂華[24]研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)棉花抗黃萎病期間，其棉苗體內(nèi)與抗病相關(guān)酶活性和一些次生代謝物質(zhì)含量的變化與棉苗抗黃萎病性相關(guān)。肖翔等[25]研究表明，脫落酸通過拮抗水楊酸抗病信號通路負(fù)調(diào)控擬南芥對白粉菌的穿透后抗性。因此，了解植物對病原菌的防御機(jī)制及病原菌對植物的感染過程和分子機(jī)理尤為重要，有利于掌握設(shè)計植物的持久抗性所需的必要知識，為改善作物對不良環(huán)境的抵御能力提供方案和對策[26]。

關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)蛹蟲草抵抗寄生性病原真菌分子機(jī)制的研究鮮見報道。為揭示培養(yǎng)基中添加GN-01的蛹蟲草與對照組蛹蟲草鮮品的基因表達(dá)差異，試驗利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，對GN-01抵抗蛹蟲草寄生性病原真菌的抗病機(jī)理在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面進(jìn)行探究，為后期開展蛹蟲草真菌病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對照組（CK）：栽培培養(yǎng)基為小麥40 g和清水60 g培養(yǎng)的蛹蟲草。

試驗組（DK）：栽培培養(yǎng)基中加入稀釋3 000倍GN-01培養(yǎng)的蛹蟲草。

蛹蟲草PT07（沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所）；總RNA提取試劑RNAiso Plus[寶生物工程（大連）有限公司]；脫氧核糖核酸酶I（北京凡知醫(yī)學(xué)科技有限公司）；NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒（美國NEB公司）；Oligo（d T）磁珠（蘇州海貍公司）；fragmentation buffer（上海恒斐生物科技有限公司）；NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒（美國NEB公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺系統(tǒng)（上海派諾森生物科技有限公司）；Agilent 2100生物分析儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序

稱取對照組和試驗組蛹蟲草樣本，各200 mg，每組樣品選取3個生物學(xué)重復(fù)，轉(zhuǎn)錄組測序委托上海派諾森生物科技有限公司完成[27]。

1.3.2 差異基因篩選

將表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞1和顯著性P值＜0.05作為篩選差異表達(dá)基因條件，滿足此篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因即為差異表達(dá)基因。

1.3.3 差異基因的功能注釋和富集

應(yīng)用基因本體論聯(lián)合會建立的數(shù)據(jù)庫所建立的數(shù)據(jù)庫GO對所獲得差異基因的GO進(jìn)行分類注釋，同時利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行KEGG通路的功能富集分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控數(shù)據(jù)分析

CK組和DK組蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)讀序分別為45 086 267和44 293 419，經(jīng)過對數(shù)據(jù)去除雜質(zhì)及接頭序列后，相應(yīng)的干凈讀序為42 704 425和41 868 819，其中各組中質(zhì)量值≥20的堿基所占比例Q20均在97.39%以上，質(zhì)量值≥30的堿基所占比例Q30均在93.58%以上，表明測序結(jié)果理想，可用于后續(xù)分析。

2.2 差異基因表達(dá)分析

對照組和試驗組共有9 618個差異基因，根據(jù)P值＜0.05和|log2Fold Change|＞1篩選顯著差異表達(dá)基因。從圖1可以看出，培養(yǎng)基中添加GN-01后，蛹蟲草子實體顯著差異基因共189個，其中上調(diào)基因83個、下調(diào)基因106個。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖

2.3 差異基因的GO富集分析

GO功能分類結(jié)果（圖2）表明：差異基因在細(xì)胞組分這類中，核小體、DNA復(fù)合包裝、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體3個條目上富集較顯著；在分子功能這類中，蛋白質(zhì)異源二聚體活動、糖基鍵的水解酶活性2個條目上富集較顯著；在生物過程這類中，碳水化合物分解代謝過程和跨膜轉(zhuǎn)運2個條目富集較顯著。

圖2 GO功能注釋

2.4 差異基因的KEGG富集分析

從圖3可以看出：189個差異基因共富集到29條通路，其中，顯著富集到糖鞘脂生物合成-globo和isglobo系列、淀粉和蔗糖代謝、酮體的合成與降解、糖胺聚糖降解、生物素代謝這5條通路，說明蛹蟲草子實體中的差異表達(dá)基因在這5條通路上受GN-01的影響較大。

圖3 KEGG功能富集圖

2.5 關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因解析

栽培培養(yǎng)基中添加GN-01后蛹蟲草子實體中關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因詳見表1。其中：與次生代謝產(chǎn)物生物合成有關(guān)的基因為MGAM，F(xiàn)abG和GALM；P4HA主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝；GSTK1主要參與植物過氧化物酶體路徑。由此可見，在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加GN-01，可有效激活次生代謝產(chǎn)物合成通路、脯氨酸代謝途徑和過氧化物酶體途徑，從而提高蛹蟲草在生長過程中的抗病能力。

表1 關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因

3 討論與結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成或提取的具有天然植物激素生理活性的化合物，可用于調(diào)節(jié)或控制植物生長發(fā)育的某些過程。研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑通?？稍谥参矬w內(nèi)傳導(dǎo)至作用部位，以很低的濃度促進(jìn)植物生長和繁殖，其特點為效用高、用量小、毒性低，在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、縮短生長周期、延長保鮮期等作用[28-29]。試驗結(jié)果表明，在栽培培養(yǎng)基中添加GN-01后，蛹蟲草子實體中顯著差異基因189個，共富集到代謝通路29條。其中，差異基因MGAM，F(xiàn)abG和GALM主要參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成，試驗發(fā)現(xiàn)，次生代謝產(chǎn)物廣泛參與植物生長、發(fā)育、防御等生理過程，可作為生化壁壘抵抗病原物的侵染過程，還可作為信號物質(zhì)參與植物的抗病反應(yīng)，在植物的抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[30]。差異基因P4HA主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝，高水平的脯氨酸可通過維持細(xì)胞膜的完整性和增強(qiáng)抗氧化能力以提高植物的抗病能力。GSTK1主要參與植物過氧化物酶體路徑，過氧化物酶體的功能是可以使毒性物質(zhì)失活，這種作用是過氧化氫酶利用過氧化氫氧化各種底物，如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的結(jié)果使這些有毒性的物質(zhì)變成無毒性的物質(zhì)，從而提高植物的抗病性。由此可見，在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加GN-01，可有效激活次生代謝產(chǎn)物合成通路、脯氨酸代謝途徑和過氧化物酶體途徑，從而提高蛹蟲草在生長過程中的抗病能力。