李 琳，陳佳意，韓秋影，李愛玲，滿江紅，潘 欣

（國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

腦膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，約占腦腫瘤的1/2。據(jù)病理學(xué)特征其可分類為星形細胞瘤、髓母細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、室管膜瘤和少突膠質(zhì)母細胞瘤等，其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的一類腫瘤，患者平均生存周期僅為12～15個月[1-2]。最常用的治療方法是手術(shù)切除結(jié)合放化療，但療效很不理想[3]。腦膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSC）是腫瘤中一類具有自我更新、多向分化潛能和腫瘤形成能力的細胞。越來越多的研究表明，GSC使腫瘤抵抗放療和化療，最終導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)[4-7]。

2011年，2個研究團隊同時發(fā)現(xiàn)CCDC109A基因編碼線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）[8-9]。MCU是一類位于線粒體內(nèi)膜分子質(zhì)量約35 ku的蛋白，控制鈣離子進入線粒體，是細胞能量代謝、產(chǎn)生活性氧和誘導(dǎo)細胞凋亡的主要介質(zhì)[10-11]，目前認為其與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。據(jù)報道，受體相互作用蛋白激酶1可通過MCU促進結(jié)腸癌能量代謝，最終促進腫瘤發(fā)展[12]。MCU通過低氧誘導(dǎo)因子1α影響血管內(nèi)皮生長因子表達，促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移[13]。MCU還可通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/去乙?；?/超氧化物歧化酶2通路促進活性氧的產(chǎn)生，從而促進肝癌細胞的侵襲和遷移[14]。

多形性膠質(zhì)母細胞瘤在腦膠質(zhì)瘤中惡性程度最高，手術(shù)切除結(jié)合放化療的療效并不理想，原因之一是其中的GSC對放化療不敏感，且具有無限增殖和自我更新的能力，能促使腫瘤發(fā)展[3-7]。因此，研究調(diào)控腦GSC對抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及治療提供了新策略。線粒體離子通道是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤靶點，能夠調(diào)節(jié)腫瘤的生長和進展[15]。已有研究報道，線粒體鈣離子吸收與乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等發(fā)展密切相關(guān)，提示靶向MCU可能是抑制腫瘤的新策略。但MCU在膠質(zhì)瘤以及腫瘤干細胞中的作用尚未闡明，且關(guān)于MCU介導(dǎo)的線粒體鈣離子信號通路在癌癥中的功能研究亦處于起步階段。因此闡明MCU在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，對于改善膠質(zhì)瘤臨床治療效果具有重要意義。本研究觀察MCU對腦GSC增殖和成瘤能力的影響，為探討MCU作為腦膠質(zhì)瘤潛在治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和儀器

BALB/c祼小鼠：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。人腦GSC（T456，T4121，T387和 T3832）、人膠質(zhì)瘤細胞（U87和U251）和人神經(jīng)干細胞（16157），美國加州大學(xué)圣迭戈分校Jeremy Rich實驗室；人星形膠質(zhì)細胞（NHA），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；人胚胎腎細胞（HEK293T），中國科學(xué)院上海細胞庫；大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞（BC102），中國博邁德基因技術(shù)有限公司；pCMV-VSVG質(zhì)粒和PAX2質(zhì)粒均由本實驗室自制獲得；兔抗人MCU多克隆抗體、細胞消化酶、Triton?X-100和抗β微管蛋白抗體，美國Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體和山羊抗小鼠IgG抗體，優(yōu)寧維生物公司；PowerUp SYBR Green Master Mix、神經(jīng)細胞基礎(chǔ)（neuro-basal）培養(yǎng)基和B-27血清替代物，美國Thermo Fisher公司；DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素混合液、左旋谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰蛋白酶和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，中國邁晨科技有限公司；胎牛血清，中國依科賽生物科技有限公司；5×PrimeScript RT Master Mix，日本TaKaRa公司；堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和重組人表皮生長因子蛋白（recombinant human epidermal growth factor protein，rhEGF），美 國 R&D Systems公司；MCU抑制劑DS16570511，美國MedChemExpress公司；質(zhì)粒提取試劑盒和Cell Titer-Glo?Luminescent細胞活力檢測試劑盒，美國Promega公司。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（FORMA3111）和PCR儀（GSX1），美國Thermo Fisher Scientific公司；微量分光儀（NanoDrop2000c），中國基因有限公司；低溫高速離心機（5424R），德國Eppendorf公司；Western電泳儀（164-5070），美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

T456，T4121，T387，T3832和16157細胞接種于干細胞完全培養(yǎng)基〔每500 mL neuro-basal培養(yǎng)基中加入B-27血清替代物10 mL，左旋谷氨酰胺5 mL，丙酮酸鈉5 mL，青/鏈霉素雙抗混合液5 mL及bFGF和rhEGF（終濃度均為10 μg·L-1）〕，U87，U251和NHA細胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基（每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清50 mL和青/鏈霉素雙抗混合液5 mL），置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MCU shRNA序列設(shè)計

在Public TRC Portal和Sigma網(wǎng)站中檢索MCU基因，獲得得分高且經(jīng)過驗證適用于pLKO.1載體的2個MCU短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干涉序列：MCU shRNA#1序列為5'-CCGGCAATCAACTCAAGGATGCAATCTCGAGATTGCATCCTTGAGTTGATTGTTTTTTG-3'，MCU shRNA#2序列為5'-CCGGCCAGCAACTATACACCACACTCTCGAGAGTGTGGTGTATAGTTGCTGGTTTTTTG-3'。同時設(shè)shRNA干涉陰性對照（shNT）序列為5'-CCGGCGCTGAGTACTTCGAAATGTCCTCGAGGACATTTCGAAGTACTCAGCGTTTTTTG-3'。上述序列由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒載體構(gòu)建

將1.3序列95℃退火，連接載體pLKO.1，構(gòu)建shNT，shMCU#1和shMCU#2及LUC-shNT，LUC-shMCU#1和LUC-shMCU#2質(zhì)粒。質(zhì)粒與大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞混合，冰上靜置30 min，然后熱激；隨后將菌液鋪板，16 h后取單菌落提取質(zhì)粒DNA測序鑒定。

1.5 含MCU shRNA慢病毒包裝、制備和細胞感染

1.5.1 慢病毒包裝和制備

直徑10 cm培養(yǎng)皿中加入DMEM完全培養(yǎng)基10 mL，每皿接種HEK293T 2.5×106細胞培養(yǎng)12 h。按磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的方法制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系：HBS 1 mL，pCMV-VSVG質(zhì)粒1.5 μg，PAX2質(zhì)粒4.5 μg，CaCl2溶液67 mL，目的質(zhì)粒（shNT，shMCU#1，shMCU#2，LUC-shNT，LUC-shMCU#1 或LUC-shMCU#2）6 μg?；靹蜢o置15 min，將轉(zhuǎn)染體系加入上述培養(yǎng)皿中，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。棄上清，換為干細胞完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，分別收集培養(yǎng)上清。上清于常溫、7000×g離心5 min，再次收集上清，用0.45 μm孔徑濾器過濾，獲得shNT，shMCU#1和shMCU#2及LUC-shNT，LUC-shMCU#1或LUC-shMCU#2慢病毒，置-80℃冰箱保存待用。

1.5.2 細胞轉(zhuǎn)染

向直徑10 cm培養(yǎng)皿中加入干細胞完全培養(yǎng)基5 mL，接種消化處理好的 T387，T3832，T4121和T456細胞，密度約為2×109L-1。加入shNT，shMCU#1和shMCU#2慢病毒或LUC-shNT，LUC-shMCU#1和LUC-shMCU#2慢病毒5 mL，混勻。置37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后細胞傳代，并加入嘌呤霉素（終濃度2 g·L-1）篩選48 h，得到成功感染shNT，shMCU#1和shMCU#2病毒的細胞，分別命名為shNT，shMCU#1和shMCU#2細胞；得到成功感染LUC-shNT，LUC-shMCU#1和LUC-shMCU#2病毒的細胞，分別命名為LUC-shNT，LUC-shMCU#1和LUC-shMCU#2細胞。

1.6 Western印跡法檢測細胞中MCU蛋白表達

將4種腦GSC和2種膠質(zhì)瘤細胞（U87和U251）吸至15 mL的離心管中，離心棄上清；加入生理鹽水10 mL洗滌細胞，再離心棄上清；加入細胞消化酶2 mL消化3 min，加入氯化鈉10 mL離心，收集細胞。將膠質(zhì)瘤細胞U87和U251用胰蛋白酶消化成懸浮單細胞，轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中離心，棄上清，收集細胞。使用實驗室自配的RIPA裂解液裂解上述細胞收集蛋白質(zhì)，經(jīng)Bradford法進行蛋白質(zhì)定量進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%牛奶封閉1 h，加入抗MCU抗體（稀釋比例1∶1000）和抗β微管蛋白抗體（稀釋比例1∶5000），4℃搖床孵育過夜。而后用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（1∶5000）室溫孵育1 h后，加入Western發(fā)光檢測液檢測MCU蛋白條帶。

1.7 RT-qPCR檢測細胞MCU mRNA水平

Trizol法提取4種腦GSC、2種膠質(zhì)瘤細胞（U87和U251）和轉(zhuǎn)染病毒的4種腦GSC總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系總體積為10 μL。取總RNA 500 ng，加入5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，雙蒸水補至10 μL，于PCR儀中37℃ 20 min，85℃ 15 s，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行RT-qPCR檢測。內(nèi)參基因β肌動蛋白上游引物為（F）AGAAAATCTGGCACCACACC，下游引物為（R）AGAGGCGTACAGGGATAGCA；MCU上游引物（F）CCACCGGACGGTACACCA，下游引物（R）GTACCTTTTCCAGGGGA-GCC。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。MCUmRNA表達水平用2-ΔΔCt表示。

1.8 CellTiter-Glo?Luminescent試劑盒檢測細胞活力

用MCU抑制劑DS16570511處理腦GSC（T456和T4121）、人神經(jīng)干細胞（16157）及人星形膠質(zhì)細胞（NHA），分別設(shè)細胞對照（0.1%DMSO）組、DS16570511 25和50 μmol·L-1組，于培養(yǎng)第0，2，4和6天檢測細胞活力，第6天觀察形成腫瘤球的大小和細胞形態(tài)。

將成功轉(zhuǎn)染shNT，shMCU#1和shMCU#2病毒的4種GSC及DS16570511處理的T387，T4121，16157和NHA細胞以每孔2000細胞加入96孔板，每孔加入所需培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)3復(fù)孔。將96孔板置37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)第0，2，4和6天加入細胞活力檢測試劑100 μL，將96孔板置Glomax全自動熒光儀，檢測各孔細胞熒光強度。細胞活力（%）=（實驗組熒光強度-對照組熒光強度）/對照組熒光強度×100%

1.9 細胞形成腫瘤球的大小和數(shù)量檢測

同1.8處理細胞，培養(yǎng)至第6天，用成像顯微鏡觀察每組細胞腫瘤球大小，同時利用手動計數(shù)器記錄每組細胞形成腫瘤球的數(shù)量。

1.10 裸小鼠顱內(nèi)原位成瘤實驗

將構(gòu)建的T387-LUC-shNT，T387-LUC-shMCU#1和T387-LUC-shMCU#2細胞及T4121-LUC-shNT，T4121-LUC-shMCU#1和T4121-LUC-shMCU#2細胞分別處理成單細胞懸液，將5×104細胞注射至麻醉的BALB/c裸小鼠腦實質(zhì)中，進針位置為：前鹵點前1 mm，中線右1 mm。每組8只。接種25 d后，用IVIS活體成像系統(tǒng)對小鼠腦部進行生物發(fā)光檢測，檢測小鼠腦內(nèi)移植瘤體積，并記錄小鼠生存時間。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示。所有實驗均重復(fù)至少3次，實驗結(jié)果采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，3組以上的比較使用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較應(yīng)用t檢驗。細胞活力比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCU在腦GSC和膠質(zhì)瘤細胞中的表達

Western印跡實驗結(jié)果（圖1A）顯示，與膠質(zhì)瘤細胞 U87和 U251相比，T4121，T387,T3832和T456 4種腦GSC中MCU蛋白表達較高。RT-qPCR結(jié)果（圖1B）顯示，除T456細胞，上述3種腦GSC中MCUmRNA水平亦高于U87和U251（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Expression of mitochondrial calcium uniporter（MCU） in brain glioma stem cells（GSCs）T456，T4121，T387 and T3832，and glioma cells U87 and U251 detected by Western blotting（A）and real timequantitative PCR（RT-qPCR）（B）.-x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with U87 cells；#P＜0.05，##P＜0.01，compaired with U251 cells.

2.2 shRNA對4種腦GSC中MCU mRNA表達的敲低效果

圖2結(jié)果顯示，與shNT相比，分別轉(zhuǎn)染shMCU#1和shMCU#2病毒4 d后，4種腦GSC中MCUmRNA水平均顯著下降（P＜0.01），其中T387-shMCU#1和T387-shMCU#2細胞下降至T387-shNT細胞的30.6%和33.8%，T4121-shMCU#1和T4121-shMCU#2細胞下降至T4121-shNT細胞的34.5%和35.1%，T3832-shMCU#1和T3832-shMCU#2細胞下降至T3832-shNT細胞的27.6%和22.0%，T456-shMCU#1和T456-shMCU#2細胞下降至T456-shNT細胞的32.3%和21.9%。

Fig.2 Knockdown effect of short hairpin RNA(shRNA)on mRNA levels of MCU in T387（A），T4121（B），T3832（C）and T456（D）cells by RT-qPCR.T387，T4121，T3832 and T456 cells were transfected with negative control shRNA（shNT），MCU-shRNA#1（shMCU#1）and MCU-shRNA#2（shMCU#2）for 96 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding shNT group.

2.3 敲低MCU表達對腦GSC活力的影響

圖3結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第6天，轉(zhuǎn)染shMCU#1和 shMCU#2慢病毒的 T387，T4121，T3832和T456細胞較各自shNT組比較，細胞活力均明顯降低（P＜0.01），表明敲低MCU表達后腦GSC增殖被抑制。

Fig.3 Effect of MCU knockdown on viability of T387（A），T4121（B），T3832（C）and T456（D）cells.See Fig.2 for the cell transfection.The cells transfected by shRNA were seeded into 96-well plates with 2000 cells per well.Cell viability was detected using the CellTiter-Glo? luminescent cell viability assay.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding shNT group.

2.4 敲低MCU表達對腦GSC形成腫瘤球大小和數(shù)量的影響

圖4結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第6天，4種腦GSC分別轉(zhuǎn)染shMCU#1和shMCU#2慢病毒后，其形成的腫瘤球較小，且數(shù)量較各自shNT組均顯著減少（P＜0.01），表明敲低MCU表達可影響GSC增殖和自我更新能力。

Fig.4 Effect of MCU knockdown on tumor sphere formation of T387，T4121，T3832 and T456 cells.See Fig.2 for the cell transfection.The formation of tumor spheres was observed on the 6thday after transfection.The morphology of tumor spheres（A）was photographed with an imaging microscope and the number of tumor spheres（B）was counted.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding shNT group.

2.5 MCU抑制劑DS16570511對GSC形成腫瘤球大小和數(shù)量的影響

圖5結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第6天，DS16570511 25 μmol·L-1可顯著抑制T387，T4121和16157細胞活力（P＜0.05，P＜0.01）及腫瘤球大?。≒＜0.05），但對NHA細胞活力影響較弱（P＜0.05），對NHA細胞形態(tài)無明顯影響；50 μmol·L-1能顯著抑制該4種細胞活力（P＜0.01），同時NHA細胞死亡。表明DS16570511 25 μmol·L-1可特異性抑制腦GSC和神經(jīng)干細胞，而對正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長無明顯影響。

Fig.5 Effect of DS16570511 on cell viability(A)and tumor sphere formation(B)of T387，T4121，16157 and NHA cells.GSC（T456 and T4121），human neural stem cells（16157）and human astrocytes（NHA）were treated with MCU inhibitor DS16570511.The cell viability was detected on the 0，2nd，4thand 6thdays.The size of tumor spheres and cell status were detected on the 6thday.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group.

2.6 敲低MCU表達抑制GSC的成瘤能力，延長小鼠生存時間

圖6結(jié)果顯示，與接種LUS-shNT細胞組相比，接種LUS-shMCU#1和LUS-shMCU#2細胞的裸小鼠顱內(nèi)移植瘤區(qū)域發(fā)光明顯減弱，祼小鼠存活時間亦顯著延長。T387-LUC-shNT細胞移植瘤小鼠平均存活33 d，敲低MCU后移植瘤小鼠平均存活時間分別延長至67和66 d；T4121-LUC-shNT細胞移植瘤小鼠平均存活34 d，敲低MCU后移植瘤小鼠平均存活時間分別延長至75和73 d。

Fig.6 Knockdown MCU inhibited tumorigenesis ability（A1，A2）of T387 and T4121 cells and prolonged survival time（B1，B2）of xenografted nude mice.The cells transfected by LUC-shRNA were injected into the intracranial of BALB/c nude mice.Bioluminescence imaging was performed on the brains of BALB/c nude mice afer 25 d，and the mouse survival time was recorded.n=8.

3 討論

本研究結(jié)果表明，MCU在GSC中高表達，且敲低MCU可抑制GSC自我更新能力和增殖，提示MCU可能是影響GSC生長的靶點。據(jù)報道，DS16570511是 MCU 抑制劑，25 μmol·L-1能顯著抑制線粒體的鈣吸收，即抑制MCU功能[16]。本研究結(jié) 果表明，DS16570511 25 μmol·L-1處理后T387，T4121和16157細胞活力明顯降低，但對NHA細胞活力和增殖影響較小，表明MCU可能特異性地在腦GSC中發(fā)揮作用。GSC的主要功能是起始腫瘤發(fā)生，促進腫瘤發(fā)展。為此，本研究構(gòu)建了裸小鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型。結(jié)果顯示，敲低MCU后裸小鼠顱內(nèi)移植瘤生長明顯緩慢，且移植瘤裸小鼠的存活時間顯著延長。上述結(jié)果表明，MCU可調(diào)控腦GSC增殖。

已知線粒體鈣具有調(diào)控細胞死亡和能量合成的重要功能。但MCU是否通過調(diào)控GSC的能量合成或其他細胞死亡途徑影響GSC增殖尚不清楚。本研究僅聚焦于MCU在腦GSC的功能，未闡明具體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，如MCU已知的調(diào)控因子腺苷酸活化蛋白激酶或鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ等在GSC中是否發(fā)揮調(diào)控MCU功能的作用值得進一步探索。

綜上所述，敲低MCU表達可抑制GSC體外增殖和自我更新能力，亦可抑制GSC在裸小鼠顱內(nèi)原位成瘤能力，且延長移植瘤小鼠的存活時間。本研究為MCU調(diào)控腫瘤發(fā)展研究提供依據(jù)，也為其調(diào)控腦GSC研究提供新思路。