謝宗杰，王 靜，韓 露，王同興，高圣喬，程肖蕊，周文霞，張永祥

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與衰老顯著相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要有認(rèn)知障礙、記憶喪失和行為異常等臨床特征。目前，治療AD只有多奈哌齊（donepezil）、卡巴拉?。╮ivastigmine）、加蘭他敏（galanthamine）、美金剛（memantine）和美金剛-多奈哌齊（memantine ER/donepezil，Namzaric）5個(gè)藥物，均獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，但它們只能在一定程度上緩解AD癥狀的加劇，療效并不理想。2019年，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)我國(guó)自主研制的糖類新藥GV-971上市，在一定程度上填補(bǔ)了國(guó)產(chǎn)AD治療藥物的空白[1]。然而尋求更有效的AD治療藥物仍然是一個(gè)亟待解決的全球性難題。

谷氨酸能系統(tǒng)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，其功能的正常和穩(wěn)定受腦內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸合成、釋放、攝取和代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)的影響，其中任一環(huán)節(jié)異常均可導(dǎo)致局部谷氨酸濃度升高。突觸間隙谷氨酸蓄積所引起的興奮性毒性被認(rèn)為是導(dǎo)致AD發(fā)生的機(jī)制之一[2]。美金剛作為N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA受體）拮抗劑，正是通過(guò)阻止過(guò)多的谷氨酸與興奮性受體結(jié)合引起的興奮性毒性發(fā)揮治療AD的作用。囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1）位于谷氨酸能神經(jīng)元的囊泡質(zhì)膜上，能特異性地將胞漿中谷氨酸裝填進(jìn)囊泡中，是神經(jīng)元釋放谷氨酸的決定性因素之一。研究報(bào)道，銀納米粒子在誘導(dǎo)谷氨酸興奮性毒性的同時(shí)伴隨VGLUT1表達(dá)降低[3]，提示突觸前轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸進(jìn)入囊泡的能力不足可能同樣參與興奮性毒性產(chǎn)生。而在AD相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）誘導(dǎo)淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老蛋白1（presenilin-1，PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠均存在VGLUT1表達(dá)下降[4-6]，臨床研究中也同樣觀察到AD患者腦內(nèi)VGLUT1表達(dá)呈年齡依賴性下降現(xiàn)象[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，快速老化小鼠P8（senescence-accelerated mouse prone 8 strain，SAMP8）腦組織VGLUT1表達(dá)亦增齡性降低[8]，其原因一方面可能是引起降解VGLUT1的胱天蛋白酶3增加而造成突觸前囊泡膜上VGLUT1減少，另一方面可能是突觸后谷氨酸受體、清除突觸間隙谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體以及谷氨酸再合成相關(guān)酶表達(dá)降低，從而引起反饋，使得突觸前囊泡膜上VGLUT1減少[9]。上述研究表明，作為控制囊泡中谷氨酸填充速度的VGLUT1表達(dá)下降可能是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。因此，本研究以VGLUT1為靶點(diǎn)進(jìn)行抗AD藥物重定位研究。

藥物重定位技術(shù)作為一種周期短、風(fēng)險(xiǎn)低的新藥發(fā)現(xiàn)策略，近年來(lái)得到了抗AD藥物研發(fā)領(lǐng)域的青睞。截止2020年，全球約有30%在研抗AD藥物采用了藥物重定位的策略（Clinicaltrials.gov），其基本思想是“一藥多靶”和“一靶多治”[10]。2006年，布羅德研究所（Broad Institute）提出的連接圖（Connectivity Map，CMap）項(xiàng)目通過(guò)獲取藥物擾動(dòng)后細(xì)胞基因表達(dá)譜信息，構(gòu)建的“藥物-基因-疾病的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)”在基于藥物重定位藥物研發(fā)策略中得到了廣泛應(yīng)用。通過(guò)比較藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜擾動(dòng)作用的相似性，研究人員成功發(fā)現(xiàn)了多種現(xiàn)有藥物的新用途[11-12]。而鑒于CMap的成功應(yīng)用，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院于2010年啟動(dòng)了該項(xiàng)目的升級(jí)版——基于網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞反應(yīng)印記整合文庫(kù)（the Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures，LINCS）計(jì)劃。截止2018年，LINCS計(jì)劃公布了包含4萬(wàn)多種小分子化合物在不同劑量下與多個(gè)細(xì)胞系反應(yīng)產(chǎn)生的上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)譜信息，這為基于藥物基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的重定位策略提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。通過(guò)分析候選藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，如根據(jù)候選藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的擾動(dòng)效果與已知藥物的相似性，或根據(jù)藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響與疾病狀態(tài)下的相反性，則可預(yù)測(cè)得到藥物潛在的新功效。

本研究以VGLUT1為靶點(diǎn)，利用高可信度MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.genego.com/）構(gòu)建VGLUT1的特征基因集合，通過(guò)計(jì)算VGLUT1特征基因集在LINCS中L1000平臺(tái)收錄的623種藥物擾動(dòng)基因表達(dá)譜中的富集情況，進(jìn)行潛在靶向VGLUT1調(diào)控藥物的快速篩選和預(yù)測(cè)，并以SAMP8為散發(fā)型AD（sporadic AD，SAD）模型，通過(guò)學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)所預(yù)測(cè)藥物改善認(rèn)知的作用進(jìn)行初步驗(yàn)證，旨在為尋找AD治療藥物提供線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物和儀器

雄性SPF級(jí)SAMP8和抗快速老化小鼠（senescence-resistant mouse prone 1 strain，SAMR1），9月齡，體重28.5～40.5 g，繁殖于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～23℃，濕度為50%～60%，每日光照和黑暗各12 h，飼養(yǎng)期間所有小鼠自由飲水及進(jìn)食。美金剛，北京偶合科技有限公司；米非司酮（mifepristone），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以10 mL·kg-1的給藥體積計(jì)算，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前每次用容量瓶分別配制100 mL美金剛（1.0 g·L-1）和米非司酮（0.325 g·L-1）于4℃冰箱中保存待用，給藥前取出適量并平衡至室溫后再ig給藥。Morris水迷宮裝置（包括迷宮宮體）（DNS-2），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；新異物體識(shí)別裝置（包括活動(dòng)測(cè)試箱）（30 cm×30 cm×30 cm，黑色不透明有機(jī)玻璃箱），本室定制；學(xué)習(xí)物體（圖1A和B，黑色實(shí)心錐體）、新物體（圖1C和D，裝有紅色墨水的錐形瓶及裝有黑色墨水的小細(xì)胞培養(yǎng)瓶）和SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)，上海欣欣信息科技有限公司。

Fig.1 Object used in object recognition memory test.A and B：two same objects for the learnning phase；C：novel object for the 1-hour test phase；D：novel object for the 24-hour test phase.

1.2 Metacore數(shù)據(jù)庫(kù)和VGLUT1特征基因集抽取

MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)系統(tǒng)的生物信息知識(shí)庫(kù)和分析工具，其收錄內(nèi)容主要包括分子相互作用、代謝物和毒理等信息及通路富集分析、基因與疾病關(guān)聯(lián)分析等工具。MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)的一大特點(diǎn)是其所收錄的信息由大量專業(yè)科研人員進(jìn)行人工數(shù)據(jù)校正，具有高精確度和高可信度。MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)迄今已收錄＞170萬(wàn)條分子相互作用信息，其中多數(shù)標(biāo)記了明確的作用方向和機(jī)制（上調(diào)或下調(diào)、抑制或激活、拮抗或激動(dòng)等）。因此，利用MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)能夠準(zhǔn)確找到直接調(diào)控VGLUT1基因的相關(guān)分子，并可將這部分?jǐn)?shù)據(jù)作為VGLUT1特征基因集。而為構(gòu)建VGLUT1特征基因集，本研究使用MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)（檢索日期：2020年03月）并選用一步擴(kuò)展算法（Expand by One Interaction Algorithm）（該算法能夠?qū)⑴cVGLUT1直接相關(guān)的基因擴(kuò)展出來(lái)），將對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄具有直接上調(diào)或下調(diào)作用的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建出來(lái)獲得VGLUT1的特征基因集。

1.3 基于基因表達(dá)譜分析的VGLUT1靶向藥物篩選

VGLUT1特征基因集反映相關(guān)的調(diào)控通路，為尋找能夠?qū)υ撏肪哂姓蛘{(diào)控作用的藥物，本研究整理了LINCS計(jì)劃的L1000平臺(tái)中收錄的623個(gè)常見(jiàn)藥物對(duì)PC3細(xì)胞不同時(shí)間和不同濃度條件下完整的表達(dá)譜數(shù)據(jù)[13]。將上述藥物表達(dá)譜基因的表達(dá)量相較于對(duì)照組的差異變化轉(zhuǎn)化為z-score形式。由于VGLUT1轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因?qū)GLUT1作用分為“激活”和“抑制”2種，因此如果某藥物能夠上調(diào)“激活”基因和下調(diào)“抑制”基因的表達(dá)，則其有望能夠?qū)GLUT1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)正向調(diào)節(jié)。本研究采用基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[14-16]法，將“激活”類調(diào)控基因作為上調(diào)基因（upV），將“抑制”類基因作為下調(diào)基因（downV），計(jì)算在藥物完整表達(dá)譜秩序列（profile ranked list，PRL）中的反映特征基因集富集程度指標(biāo)富集分?jǐn)?shù)（enrichment score，ES）值。GSEA法首先將完整表達(dá)譜基因z-score的排序轉(zhuǎn)化為PRL形式，通過(guò)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)計(jì)算VGLUT1特征基因集“激活”基因和“抑制”基因在藥物表達(dá)譜PRL中累計(jì)分布程度的ESup和ESdown，然后綜合考慮得到總體富集分?jǐn)?shù)ES值，其范圍在-1～1之間。ES值越高，表示藥物促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄程度越高，負(fù)值則表示抑制VGLUT1轉(zhuǎn)錄的傾向。

本研究使用基于Kolmogorov-Smirnov統(tǒng)計(jì)的GSEA法來(lái)量化VGLUT1特征基因集在被比較藥物的表達(dá)譜PRL中的富集程度（包括頂部或底部），并將結(jié)果用ES呈現(xiàn)。本研究用｛upV，downV｝表示VGLUT1特征基因集的“激活”基因和“抑制”基因，用ESup和ESdown分別表示”激活”基因和“抑制”基因集在藥物表達(dá)譜PRL中的富集程度。如PRL長(zhǎng)度為m，且包含的n個(gè)基因在PRL中排名為R1，R2，R3，……，Rk，則可得如下ESup：

如a＞b，則ESup=a；如b＞a，則ESup=-b。

ESdown計(jì)算原理相同。包含上下調(diào)基因的總體ES表示為：

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1 動(dòng)物分組和處理

將小鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行自主活動(dòng)性測(cè)試，隨后依據(jù)自主活動(dòng)性和體重將SAMP8隨機(jī)分為對(duì)照組（n=12）、陽(yáng)性藥物美金剛組（ig，10 mg·kg-1，n=9）和米非司酮組（ig，3.25 mg·kg-1，n=9），同時(shí)設(shè) SAMR1對(duì)照組（n=13）；SAMP8和SAMR1對(duì)照組ig給予去離子水10 mL·kg-1；每天1次，共3個(gè)月。米非司酮給藥劑量參考臨床劑量即每天25 mg，據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人的體表面積比例表》換算而得。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

參考Wang等[17-18]方法，在給藥3個(gè)月后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SAMP8和SAMR1空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為定向航行階段（空間學(xué)習(xí)期）和空間探索階段（空間測(cè)試期）。在學(xué)習(xí)期記錄逃避潛伏期，測(cè)試期記錄逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間。

1.4.3 新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠物體識(shí)別記憶能力

參考Wang等[17]和 Leger等[19]等的方法，采用新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SAMP8和SAMR1的物體識(shí)別記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期、學(xué)習(xí)期和測(cè)試期。學(xué)習(xí)期所用物體為相同的黑色實(shí)體組合體A和B，1 h測(cè)試期采用的物體C為裝有紅色墨水的錐形瓶，24 h測(cè)試期采用的物體D為裝有黑色墨水的小細(xì)胞培養(yǎng)瓶（圖1）。記錄指標(biāo)分別為物體探索時(shí)間和偏好指數(shù)。偏好指數(shù)=新異物體探索時(shí)間/總探索時(shí)間。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnettt檢驗(yàn)進(jìn)行多組和兩組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VGLUT1特征基因集構(gòu)建

通過(guò)MetaCore數(shù)據(jù)庫(kù)選用一步擴(kuò)展算法對(duì)VGLUT1特征基因進(jìn)行抽取，結(jié)果獲得了16個(gè)對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄具有激活作用的基因，11個(gè)對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄具有抑制作用的基因（表1）。

Tab.1 Gene sets with direct regulatory effect on vesicular glutamate transporter 1（VGLUT1）transcription

2.2 基于LlNCS的促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄候選藥物預(yù)測(cè)及篩選

為尋找潛在的可上調(diào)VGLUT1表達(dá)的藥物，本研究基于LINCS收錄的藥物表達(dá)譜信息，對(duì)VGLUT1特征基因集在藥物擾動(dòng)后表達(dá)譜上調(diào)基因的富集情況進(jìn)行分析，以對(duì)VGLUT1調(diào)控基因集具有促進(jìn)作用的藥物為目標(biāo)，對(duì)候選藥物進(jìn)行篩選預(yù)測(cè)。

富集分析所得ES值表示藥物對(duì)VGLUT1調(diào)控通路的作用。正值表示可促進(jìn)上調(diào)基因或抑制下調(diào)基因，即促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄；負(fù)值表示可抑制上調(diào)基因或促進(jìn)下調(diào)基因，即抑制VGLUT1轉(zhuǎn)錄；絕對(duì)值大小表示促進(jìn)或抑制程度。預(yù)測(cè)結(jié)果中對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄具有潛在促進(jìn)作用的藥物排名前5的為氟尼縮松（flunisolide）、谷氨酰胺、阿那曲唑（anastrozole）、米非司酮和雷替曲塞（raltitrexed）（表2）。全部預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)附件《促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄的藥物預(yù)測(cè)》（http：//cjpt.magtechjournal.com/CN/item/downloadFile.do?id=10056）。

Tab.2 Top five drugs with potential to promote VGLUT1 transcription on PC3 cells

在GSEA結(jié)果（圖2）中可見(jiàn)，upV主要富集于米非司酮的上調(diào)基因區(qū)域，downV主要富集于米非司酮的下調(diào)基因區(qū)域，提示米非司酮對(duì)VGLUT1調(diào)控通路具有促進(jìn)作用，即可能促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。

Fig.2 VGLUT1 gene sets in mifepristone gene expression profile.A：genes with up-regulated effect on the transcription of VGLUT1 in GESA（upV）；B：genes with down-regulated effect on the transcription of VGLUT1 in GESA（downV）.NES=-1.753.

2.3 米非司酮對(duì)SAMP8小鼠認(rèn)知功能的影響

2.3.1 對(duì)SAMP8空間學(xué)習(xí)記憶的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)，除SAMR1組外，3組SAMP8均有4只死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，在空間學(xué)習(xí)期第3～6天及空間測(cè)試期，SAMP8逃避潛伏期均顯著長(zhǎng)于SAMR1（P＜0.01），且在空間測(cè)試期穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間均顯著少于SAMR1（P＜0.01）。給予美金剛和米非司酮對(duì)SAMP8逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)未產(chǎn)生明顯影響，但SAMP8在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。提示SAMP8空間記憶能力出現(xiàn)損傷，美金剛和米非司酮均可顯著改善SAMP8的空間記憶能力。

Fig.3 Effect of mifepristone on spatial learning and memory in senescence-accelerated mouse prone 8 strain（SAMP8）.SAMP8 were ig administrated with deionized water（100 mL·kg-1），memantine（10 mg·kg-1）and mifepristone（3.25 mg·kg-1），respectively.Senescence-accelerated mice resistant-1 strain（SAMR1）were ig administrated with deionized water（100 mL · kg-1）.Three months later，behavioral tests were conducted with Morris water maze.A：latency in learning phase；B：latency in probe phase；C：number of crossing platform in probe phase；D：swimming time in target quadrant in probe phase.x± s，n=13（SAMR1），8（SAMP8）and 5（SAP8+memantine and SAMP8+mifepristone）.＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 group；#P＜0.05，compared with SAMP8 group.

2.3.2 對(duì)SAMP8物體識(shí)別記憶能力的影響

新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)時(shí)，SAMR1組有4只死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A）顯示，學(xué)習(xí)期間受試小鼠對(duì)2個(gè)相同物體的探索時(shí)間相近，表明測(cè)試系統(tǒng)正確。學(xué)習(xí)后1和24 h分別更換新物體測(cè)試結(jié)果（圖4B和C）顯示，在1 h測(cè)試期時(shí)，各組小鼠偏好指數(shù)無(wú)明顯差異；在24 h測(cè)試期時(shí)，SAMP8偏好指數(shù)顯著低于SAMR1（P＜0.05），給予美金剛和米非司酮SAMP8未提高其偏好指數(shù)。

Fig.4 Effect of mifepristone on object recognition memory in SAMP8.See Fig.1 for the mouse treatment.A：exploring time in learning phase；B and C：preference index in 1 and 24 h after training，respectively.±s，n=9（SAMR1），8（SAMP8）and 5（SAP8+memantine and SAMP8+mifepristone）.＊P＜0.05，compared with SAMR1 group.

3 討論

本研究以VGLUT1為靶點(diǎn)，通過(guò)MetaCore高可信度生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲取對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄具有直接調(diào)控作用的特征基因集合，并進(jìn)一步通過(guò)GESA富集分析得到VGLUT1特征基因集在LINCS計(jì)劃中L1000平臺(tái)收錄的623個(gè)常見(jiàn)藥物表達(dá)譜PRL中的累計(jì)分布程度，以富集分?jǐn)?shù)ES值評(píng)估藥物對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄潛在的促進(jìn)或抑制作用。結(jié)果顯示，VGLUT1調(diào)控基因集在氟尼縮松、谷氨酰胺、阿那曲唑、米非司酮和雷替曲塞5個(gè)藥物中具有較高的富集得分，它們對(duì)VGLUT1轉(zhuǎn)錄可能具有促進(jìn)作用。

氟尼縮松是一種具有抗炎作用皮質(zhì)類固醇，臨床上主要用于過(guò)敏性鼻炎和哮喘。雷替曲塞是一種用于化療的抗代謝藥物，是一種胸苷酸合酶抑制劑。目前暫無(wú)兩者與AD或認(rèn)知功能相關(guān)的研究報(bào)道。阿那曲唑是一種非甾體芳香酶抑制劑，是臨床上治療絕經(jīng)后女性乳腺癌的首選內(nèi)分泌藥物。據(jù)報(bào)道，阿那曲唑給藥增加雌性APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊面積[20]，可能是雌激素對(duì)AD典型病理特征的影響。谷氨酰胺作為一種非必需氨基酸，廣泛存在于全身，參與多種代謝過(guò)程。最近有研究報(bào)道，谷氨酰胺可通過(guò)激活Wnt3a/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路改善SAMP8氧化應(yīng)激損傷和在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力[21]。米非司酮是一種強(qiáng)抗孕激素和糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，目前臨床上用于抗早孕以及治療糖皮質(zhì)激素分泌過(guò)多導(dǎo)致的庫(kù)欣綜合征（Cushing syndrome）。Baglietto-Vargas 等[22]研究認(rèn)為，循環(huán)糖皮質(zhì)激素增多與衰老和AD有關(guān)，糖皮質(zhì)激素過(guò)高可導(dǎo)致APP錯(cuò)誤剪切，加速Aβ沉積，引起Tau蛋白過(guò)度磷酸化。而米非司酮可通過(guò)誘導(dǎo)APP裂解為17 ku片段阻止Aβ形成，并降低Tau蛋白磷酸化，改善APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。此外，Pedrazzoli等[23]同樣發(fā)現(xiàn)，米非司酮具有抑制APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增加樹(shù)突棘密度的作用。上述研究提示，米非司酮具有成為抗AD藥物的潛力，但其對(duì)AD模型動(dòng)物和AD患者谷氨酸能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

不同AD模型動(dòng)物如家族型AD模型APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠以及Aβ誘導(dǎo)的AD模型小鼠腦內(nèi)VGLUT1表達(dá)均降低[4-6]，且AD患者腦內(nèi)VGLUT1表達(dá)亦呈年齡依賴性下降[7]，表明作為谷氨酸能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)的重要參與者，VGLUT1對(duì)AD發(fā)生發(fā)展具有重要意義。本研究結(jié)果表明，米非司酮對(duì)VGLUT1調(diào)控基因集具有正向促進(jìn)作用，即具有促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，SAD模型SAMP8腦內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)傳遞異常，表現(xiàn)為興奮性毒性和VGLUT1表達(dá)降低[9]。本研究以SAMP8為模型，發(fā)現(xiàn)米非司酮具有提高SAMP8空間學(xué)習(xí)記憶能力的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗AD作用，并提示通過(guò)上調(diào)VGLUT1表達(dá)維持谷氨酸能系統(tǒng)穩(wěn)定可能是其發(fā)揮抗AD作用機(jī)制之一。但由于SAMP8加速老化和壽命較短的局限導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SAMP8死亡，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性藥美金剛和米非司酮組只有5只小鼠，所得陽(yáng)性結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證，但對(duì)于重定位預(yù)測(cè)結(jié)果仍具有一定的參考價(jià)值。后續(xù)擬進(jìn)一步對(duì)氟尼縮松和雷替曲塞改善AD模型動(dòng)物認(rèn)知能力的作用進(jìn)行驗(yàn)證，該作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上所述，本研究基于VGLUT1調(diào)控基因集和LINCS藥物表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行抗AD藥物篩選，發(fā)現(xiàn)抗AD藥物可導(dǎo)致與促進(jìn)VGLUT1轉(zhuǎn)錄相似的表達(dá)譜變化，從而發(fā)現(xiàn)潛在的抗AD候選藥物。該方法既可全面考察藥物對(duì)細(xì)胞作用的整體特征，又可避免細(xì)胞基因表達(dá)漲落和芯片噪聲的影響，是藥物重定位研究的理想策略之一。此外，SAMP8為SAD的典型模型，SAD在AD患者中占比＞90%。本研究以SAMP8為模型，對(duì)米非司酮抗AD作用進(jìn)行驗(yàn)證，不僅進(jìn)一步提示其作為抗AD藥物的潛力，同時(shí)也為闡明其抗AD作用機(jī)制提供了新的探索方向。