歐陽碧云，王俊程，趙秀蘭

（山東大學齊魯醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東 濟南 250012）

超重和肥胖是心血管疾病、高血壓和糖尿病等多種慢性疾病的重要誘因，特別是肥胖現(xiàn)已成為廣受關(guān)注的全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。超重和肥胖為體內(nèi)異常的脂肪累積，是由能量攝入與消耗失衡導(dǎo)致的。近年來研究表明，肥胖的發(fā)生亦與環(huán)境污染密切相關(guān)，許多環(huán)境污染物能夠通過多種途徑導(dǎo)致能量失衡[3]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）廣泛用于生產(chǎn)食品包裝材料、化妝品、醫(yī)療用品、建筑材料和兒童玩具，是目前使用量最大的增塑劑。人群流行病調(diào)查資料顯示，DEHP暴露與胰島素抵抗和肥胖代謝綜合征相關(guān)[4]。本課題組動物實驗研究表明，DEHP能夠增加C57小鼠體重，并伴隨C57小鼠皮下脂肪組織分解降低[5-6]。3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞（前脂肪細胞）具有分化為脂肪細胞的潛能，是目前研究脂肪細胞分化的常用模型[7]。本研究觀察DEHP對3T3-L1前脂肪細胞成脂誘導(dǎo)分化和脂肪分解影響，進一步探討DEHP對脂質(zhì)代謝的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DEHP、油紅O、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、3-異丁-1-甲黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松和胰島素，美國Sigma-Aldrich公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素，美國Gibco公司；胰蛋白酶，美國Hyclone公司；甘油三酯（triglycerides，TG）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，美國Pierce Biotechnology公司；兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶A（phosphorylated protein kinase A，p-PKA）底物、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）、Ser563位點磷酸化HSL（p-HSL Ser563）和p-HSL Ser660多克隆抗體，美國Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）和脂肪TG脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）單克隆抗體及Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG抗體，美國Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體，美國Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Olympus BX 43正置顯微鏡，日本Olympus有限公司；EVOS FL熒光顯微鏡，美國Thermo Fisher Scientific公司；Infinite?M200 Pro多功能酶標儀，瑞士TECAN公司。

1.2 3T3-L1前脂肪細胞成脂分化誘導(dǎo)和DEHP處理

3T3-L1前脂肪細胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)。細胞融合度達90%時，采用雞尾酒誘導(dǎo)法誘導(dǎo)成脂分化，即依次給予誘導(dǎo)液A（IBMX 0.5 mol·L-1、地塞米松 2.5 mmol·L-1和胰島素2 mg·L-1）和誘導(dǎo)液B（胰島素2 mg·L-1）分別誘導(dǎo)3和4 d，其后更換含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d（第10天）。誘導(dǎo)液A和誘導(dǎo)液B加入的同時給予DEHP暴露，DEHP終濃度分別為0（細胞對照組），3.125，6.25，12.5，25和50 μmol·L-1。DEHP采用DMSO溶解，細胞對照組給予等體積DMSO（終濃度為0.5%），各組設(shè)6復(fù)孔。誘導(dǎo)分化過程中，每天采用顯微鏡觀察細胞內(nèi)脂滴大小和數(shù)量的變化。

1.3 油紅O染色檢測誘導(dǎo)成脂分化細胞中脂滴形成

按1.2處理細胞，于第10天采用油紅O對細胞內(nèi)脂肪進行染色。細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定、蒸餾水洗滌和60%異丙醇潤洗后，油紅O室溫避光染色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察脂滴的大小和數(shù)量，細胞內(nèi)油紅O著色部分即為脂滴。

1.4 成脂分化細胞外TG水平和細胞內(nèi)脂肪含量檢測

按1.2處理細胞，于第10天取細胞培養(yǎng)液，用TG試劑盒測定培養(yǎng)液即細胞外中TG水平。TG水平（mmol·L-1）=（樣本A546nm-空白A546nm）/（校準A546nm-空白A546nm）×校準品濃度（mmol·L-1）。收集細胞，進行油紅O染色。染色后先用PBS洗滌，隨后加異丙醇2 mL洗脫細胞脂肪染色，于562 nm處檢測洗脫液吸光度（A562nm）值。A562nm值表示細胞內(nèi)脂肪含量。

1.5 Western印跡法檢測成脂分化細胞中脂肪分解相關(guān)蛋白的表達

按1.2處理細胞，于第10天棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后加入RIPA蛋白裂解液，冰浴中裂解30 min；4℃，12 000×g離心10 min，取上清，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白質(zhì)含量并定量，隨后加入等體積上樣緩沖液，置金屬浴中變性10 min。取20 μg變性蛋白進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜后，分別加入抗p-PKA底物、HSL、p-HSL Ser563、p-HSL Ser660、UCP1和ATGL單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標記山羊抗兔IgG抗體（1∶5000）室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液后感光X膠片，Image J軟件進行積分吸光度分析。GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達水平。

1.6 免疫熒光實驗檢測誘導(dǎo)成脂分化細胞中UCP1表達

按1.2處理細胞，于第10天經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，加入0.5%Triton X-100通透20 min；PBS洗滌，加山羊血清室溫封閉30 min；加入兔抗小鼠UCP1單克隆抗體（1∶500）4℃孵育過夜；PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG抗體（1∶5000），室溫避光孵育1 h；含DAPI防熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。細胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光的細胞即為UCP1表達陽性細胞，采用Image J計數(shù)該細胞。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS20.0軟件單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用LSD（方差齊）或Dunnett'sT3（方差不齊）分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEHP對3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞脂滴形成的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)脂肪分化第5天，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細胞內(nèi)可見小脂滴，細胞對照組無脂肪滴出現(xiàn)（圖1A）。誘導(dǎo)分化第6天，細胞對照組細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量與細胞對照組相比明顯增多（圖1B）；第10天，與細胞對照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組油紅O著色細胞增多，其中DEHP 12.5，25和50 μmol·L-1組脂滴數(shù)量增加較為明顯，DEHP 50 μmol·L-1組細胞中可觀察到含有較大脂滴和“指環(huán)”樣脂肪細胞（圖1C）。

Fig.1 Effect of diethylhexyl phthalate（DEHP）on formation of lipid drops in induced adipogenic differentiated 3T3-L1 cells（200×）.The adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes were induced by differentiation medium A（3-isobutyl-1-methylxanthine 0.5 mol·L-1，dexamethasone 2.5 mmol·L-1and insulin 2 mg·L-1）for 3 d，and differentiation medium B（insulin 2 mg·L-1）for 4 d followed by continuous culture for 3 d（the 10thday），which was simultaneous combined with DEHP 3.125-50 μmol·L-1treatment.A：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 5thday of induced differentiation；B：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 6thday of induced differentiation；C：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 10thday by oil red O staining.Arrows show the lipid droplets.

2.2 DEHP對3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞外TG水平和細胞內(nèi)脂肪含量的影響

與細胞對照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組3T3-L1前脂肪細胞成脂誘導(dǎo)分化后細胞外TG水平和細胞內(nèi)脂肪含量均明顯增加（P＜0.01），其中DEHP 12.5 μmol·L-1組增加更為明顯（圖2），提示DEHP處理可明顯增加3T3-L1成脂誘導(dǎo)分化。

Fig.2 Effect of DEHP on extracellular triglycerides（TG）level（A）and intracellular fat content（B）in induced adipogenic differentiated 3T3-L1 cells.See Fig.1 for the cell treatment.On the 10thday of induction，the TG level of culture medium was detected by TG assay kit and the cells were stained with oil red O.The stained cells were washed by PBS and eluted with 2 mL isopropanol，then the A562 nmof the elution was detected by spectrophotometry.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 DEHP對3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞脂肪分解通路相關(guān)蛋白表達的影響

與細胞對照組相比，DEHP 12.5～50 μmol·L-1組細胞中ATGL蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01），DEHP 3.125～50 μmol·L-1組p-PKA底物蛋白水平亦明顯下降（P＜0.01）（圖3）；DEHP 3.125～50 μmol·L-1組p-HSL Ser563和p-HSL Ser660蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），總HSL蛋白表達水平無明顯變化（圖4）。

Fig.3 Effect of DEHP on protein expressions of phosphorylated protein kinase A（p-PKA）substrate and adipose triglyceride lipase（ATGL）in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.4 Effect of DEHP on protein expressions of hormonesensitive triglyceride（HSL），phosphorylated HSL at Ser563（p-HSL Ser563）and p-HSL Ser660 in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 DEHP對3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞UCP1表達的影響

Western印跡法結(jié)果（圖5A）顯示，與細胞對照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細胞中UCP1蛋白表達水平隨DEHP濃度增加明顯降低（P＜0.01）。免疫熒光法檢測結(jié)果（圖5B）與上述結(jié)果變化趨勢相似，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組UCP1表達陽性細胞數(shù)目與細胞對照組相比亦明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of DEHP on protein expression of uncoupling protein 1（UCP1）in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting and immunofluorescence assay.See Fig.1 for the cell treatment.A：the expression of UCP1 protein；B：the number of UCP1 positive cells，the arrows show the UCP1 positive cells（200×）；A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

塑料污染已引起全球關(guān)注。作為使用最為廣泛的塑料添加劑，DEHP的健康效應(yīng)引起廣泛關(guān)注[8]。人群調(diào)查資料和動物研究顯示，DEHP與肥胖密切相關(guān)，但確切的作用機制尚不明確[9-10]。脂肪細胞分化是肥胖發(fā)生發(fā)展的早期關(guān)鍵事件。3T3-L1前脂肪細胞是研究脂肪代謝紊亂最常用的細胞模型之一，通常采用誘導(dǎo)劑促進其分化為成熟脂肪細胞。Hao等[11]已報道，對3T3-L1前脂肪細胞采用單純胰島素誘導(dǎo)成脂分化的同時給予DEHP暴露，未觀察到DEHP對3T3-L1細胞脂肪分化具有明顯促進作用。本研究采用經(jīng)典雞尾酒法，即序貫加入IBMX、地塞米松和胰島素組成的A液和含胰島素B液進行成脂分化誘導(dǎo)，同時給予DEHP暴露。形態(tài)學結(jié)果顯示，DEHP可使3T3-L1前脂肪細胞中脂滴出現(xiàn)更早，脂滴體積和數(shù)量也明顯增加。對細胞內(nèi)油紅O著色的脂肪滴洗脫液脂肪含量和培養(yǎng)液中TG水平檢測結(jié)果表明，DEHP可明顯增加3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化后細胞內(nèi)脂肪含量和細胞外TG水平。已知DEHP進入體內(nèi)后可代謝為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP是過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）的激活劑[12]，PPARγ是脂肪分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。本課題組采用PPARγ過表達的NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細胞研究表明，與野生型NIH-3T3細胞相比，DEHP和MEHP均能明顯促進PPARγ過表達細胞中脂滴形成，且MEHP的促進作用更強（待發(fā)表）。故推測DEHP對3T3-L1前脂肪細胞成脂分化的促進作用可能部分由于其在細胞內(nèi)代謝形成MEHP并激活PPARγ所致。

脂肪細胞以TG的形式儲存剩余能量，TG的分解與合成是生物體脂肪積累的重要調(diào)節(jié)因素。通常TG分解需經(jīng)ATGL、活化的HSL和甘油單酯脂肪酶共同完成。ATGL首先將TG水解為甘油二酯和游離脂肪酸，甘油二酯隨后可活化HSL水解生成甘油單酯和游離脂肪酸，甘油單酯繼續(xù)在甘油單酯脂肪酶的作用下水解為甘油和游離脂肪酸。HSL的激活需在活性PKA作用下將563位點和660位點的絲氨酸磷酸化，組織中PKA活性一般由磷酸化PKA底物的水平表示[14]。通常刺激因素作用于脂肪細胞表面腎上腺素受體，激活細胞內(nèi)腺苷酸活化酶，升高環(huán)磷酸腺苷水平，導(dǎo)致PKA活化，磷酸化激活HSL，參與甘油二酯水解[15]。本研究結(jié)果顯示，DEHP降低了ATGL的表達，同時觀察到DEHP處理后細胞中PKA的活性也明顯降低，伴隨HSL660和563位點絲氨酸磷酸化水平的明顯下降，提示DEHP抑制了HSL的激活。Ellero-Simatos等[16]對人源皮下前脂肪細胞誘導(dǎo)成脂分化11 d，在成脂分化率達70%時加入 MEHP100 μmol·L-1作用48 h。結(jié)果表明，細胞內(nèi)TG含量明顯升高；但作用24 h時成脂分化和脂肪分解相關(guān)基因ATGL和HSL表達均上調(diào)。另有研究報道，3T3-L1首先給予DEHP暴露2 d，其后再常規(guī)誘導(dǎo)成脂分化，至第8天誘導(dǎo)完成時，細胞增殖明顯提高，但細胞內(nèi)TG含量明顯降低[17]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果不一致，可能與DEHP作用時間和作用方式不同所致。

UCP1是棕色脂肪組織線粒體中特異表達的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)，該蛋白解偶聯(lián)呼吸鏈、進而產(chǎn)熱，能減少體內(nèi)脂肪累積。研究顯示，白色脂肪細胞向棕色脂肪細胞轉(zhuǎn)化能增加全身能量消耗，并減少體內(nèi)脂肪，該作用與UCP1表達密切相關(guān)[18]。本研究用Western印跡法和免疫熒光法檢測3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞中UCP1表達水平。結(jié)果均顯示，DEHP明顯降低3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細胞內(nèi)UCP1蛋白的表達，提示DEHP處理細胞脂肪含量增加也可能與UCP1表達降低相關(guān)。本課題組先前動物實驗結(jié)果表明，雄性C57小鼠經(jīng)灌胃分別給予DEHP 0.05 mg·kg-1（環(huán)境相關(guān)劑量）和500 mg·kg-1（導(dǎo)致明顯生殖功能損傷劑量）連續(xù)13周，小鼠脂肪組織中UCP1、p-PKA底物、HSL及p-HSL Ser563和p-HSL Ser660蛋白表達水平均明顯降低[6]，與本研究體外實驗結(jié)果一致。

考慮到無誘導(dǎo)劑時3T3-L1前脂肪細胞成脂能力低且成脂分化率不穩(wěn)定，本研究未觀察DEHP對非誘導(dǎo)細胞的成脂促進作用。同時，在DEHP＞12.5 μmol·L-1時，也未觀察到細胞外TG水平和細胞內(nèi)脂肪含量具有明顯的濃度依賴性。高濃度DEHP作用下，成脂分化細胞中脂滴較大但易脫落，推測該現(xiàn)象可能是高濃度時細胞內(nèi)外脂肪含量無明顯增加的原因之一。

綜上，本研究結(jié)果表明，DEHP促進3T3-L1前脂肪細胞的成脂分化，并抑制脂肪分化細胞的脂肪分解，提示DEHP可能是促進肥胖發(fā)生的潛在危險因素，具體分子機制待深入探討。